Лекционный курс (1128712), страница 15

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

18), или же непосредственно вырезать (с помощьюспециальных ферментов) нужный участок ДНК. В последних двух случаях получить48нужный ген в чистом виде практически невозможно, поэтому в дальнейшие манипуляциивводится «грязный» образец.Для размножения полученного генетического материала необходимо ввести его в клетку,используя так называемые вектора молекулы ДНК, способные автономно размножатьсявнутри клетки. Основные свойства векторов: способность к автономной репликации,наличие уникальных участков расщепления под действием эндонуклеаз рестрикции,наличие маркерных белков (соответствие генетического кода вектора белкам обладающимспецифическими свойствами).

Обычно в качестве векторов используют плазмиды ивирусы (особенно бактериофаги).Рассмотрим дальнейшие превращения на примере встраивания исследуемого гена вплазмиду pBR322, содержащую гены устойчивости к антибиотикам (ампициллину итетрациклину). Под действием фермента, относящегося к группе эндонуклеаз рестрикции(ферменты, селективно расщепляющие нуклеотидную цепь в одном конкретном месте),такая плазмида раскрывается на участке, ответственном за устойчивость к ампициллину.При этом образуется линейная молекула, имеющая так называемые липкие концы(однонитевые фрагменты d(pTpCpCpA)-OH), к которым легко может присоединитьсянуклеотид, обладающий необходимым набором сопряжённых оснований.

Есливстраиваемый генетический набор получен химическим путём, то внедрение такихнаборов на концах цепи не составляет труда; если же фрагмент был выделен из м-РНК(ДНК) клетки, то необходимые липкие концы образуются под действием ферментадезоксинуклеотидил трансферазы. После соединения липких концов, в результатедействия ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы возникшие в ходе синтеза «дырки» зашиваются,образуется новая плазмида, содержащая необходимый ген и называемая рекомбинантнойДНК, Полученные таким путём плазмиды внедряются в клетку-хозяина, где начинаютреплицироваться.Между тем, исследуемый ген внедряется далеко не во все плазмиды; для отборанеобходимых плазмид требуется процедура, называемая клонированием ДНК илискринингом («разборкой» полученных молекул). В принципе, клон генетическиидентичное потомство одной клетки, поэтому само понятие «клонирование ДНК»бессмысленно.

Однако традиционно процесс размножения генетического материаланазывают именно так, поскольку в ходе размножения рекомбинантных ДНК образуютсяклоны семейства генетически идентичных клеток. Для отбора необходимых клетокиспользуют свойства устойчивости к антибиотикам: вначале клоны помещают натетрациклин (отсеиваются плазмиды, в которых внедрение произошло в неправильномместе), затем - на ампициллин (разделяются рекомбинантные ДНК и исходные плазмидыpBR322). Существует и другой способ отбора, называемый молекулярной гибридизацией: кхарактерному участку встраиваемого гена присоединяют последовательностькомплиментарных нуклеотидов, несущую радиоактивную метку, после чего отделяютрадиоактивные ДНК от нерадиоактивных.

Подобная операция особенно необходима в томслучае, когда используемый генетический материал не является чистым, а выделен изДНК или м-РНК; вначале образуется так называемая библиотека комплиментарных ДНК(кДНК), из которой необходимо выбрать нужную.Таким путём осуществляется размножение генетического материала; если цельюисследования является синтез белка на природной рибосоме, то в качестве векторавыбирают плазмиду, разрывающуюся вблизи участка, содержащего активный промотер. Врезультате на рекомбинантной ДНК активирована транскрипция встроенного участка, чтоприводит к активной экспрессии внедрённого гена.9.

Трансгенные организмыТрансге́нный органи́зм — живой организм, в геном которого искусственно введен гендругого организма.Ген вводится в геном хозяина в форме так называемой «генетической конструкции» —последовательности ДНК, несущей участок, кодирующий белок, и регуляторные49элементы (промотор, энхансер и пр.), а также в некоторых случаях элементы,обеспечивающие специфическое встраивание в геном (например, т. н. «липкие концы»).Генетическая конструкция может нести несколько генов, часто она представляет собойбактериальную плазмиду или ее фрагмент.Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новымисвойствами.

Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедренв геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическаяэкспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессиянового гена).Создание трансгенных организмов используют: в научном эксперименте для развития технологии создания трансгенныхорганизмов, для изучения роли определенных генов и белков, для изучения многихбиологических процессов; огромное значение в научном эксперименте получилитрансгенные организмы с маркерными генами (продукты этих генов с легкостьюопределяются приборами,например зелёныйфлуоресцентный белок,визуализируют с помощью микроскопа, так легко можно определитьпроисхождение клеток, их судьбу в организме и т. д.); в сельском хозяйстве для получения новых сортов растений и пород животных; в биотехнологическом производстве плазмид и белков.10.

ГенотерапияГенотерапия — совокупность генноинженерных (биотехнологических) и медицинскихметодов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматическихклеток человека в целях лечения заболеваний. Это новая и бурно развивающаяся область,ориентированная на исправление дефектов, вызванных мутациями (изменениями) вструктуре ДНК, или придания клеткам новых функций.Новые подходы к генной терапии соматических клеток можно поделить на две большиекатегории: генная терапия ex vivo и in vivo. Разрабатываются специфическиелекарственные препараты на основе нуклеиновых кислот: РНК-ферменты,модифицированные методами генной инженерии олигонуклеотиды, корректирующиегенные мутации in vivo и т.

д.Существует несколько способов введения новой генетической информации в клеткимлекопитающих. Это позволяет разрабатывать прямые методы лечения наследственныхболезней — методы генотерапии.Используют два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней: фетальная генотерапия, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу илиэмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введенный материалпопадет во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самымпередачу следующему поколению); соматическая генотерапия, при которой генетический материал вводят только всоматические клетки и он не передается половым клеткам.50II частьЭнзимология1.

Ферменты как природные катализаторы. Основные отличия ферментативногокатализа от традиционного химического. Ферменты в химии.Ферменты - высокоактивные белковые катализаторы.Отличия ферментативного катализа:1) Высокая активность (разница в скорости одной и той же реакции, катализируемойферментом или небелковой частицей - например, протоном - может составлять 10-15порядков).2) Высокая селективность (ферменты обычно катализируют только один конкретныйхимический процесс).3) Высокая эффективность (отсутствие побочных продуктов и дисбаланса «продуктсубстрат»).Ферменты в химии:1)Физическая химия исследует структуры белков и активных центров методами РСА,ЯМР, ЭПР, а также кинетику и механизмы действия ферментов.2)Органическая химия - тонкий органический синтез, крупномасштабныесинтетические процессы.3)Аналитическая химия - иммуноферментный анализ, биолюминесцентный анализ,биосенсоры.4) Неорганическая химия исследует поведение ионов металлов в активных центрах.5) Химическая технология - производство лекарств, аминокислот и др.

веществ.6)Электрохимия - биоэлектрокатализ, то есть ферментативный катализ электродныхпроцессов.7)Коллоидная химия изучает белки как коллоидные частицы, а также поведениеферментов в обращённых мицеллах (мицеллярная энзимология).2. Источники ферментов. Нахождение ферментов в природных объектах,локализация ферментов в клетке.Микроорганизмы являются наиболее ценным источником ферментов в биохимии,поскольку1)они имеют более высокие скорости роста;2) их можно получить в больших количествах в ферментерах в контролируемых условиях,что экономически выгодно;3) они осуществляют широкий спектр химических реакций;4) их свойства можно легко улучшить с помощью методов генной инженерииНекоторые ферменты выделяют из лекарственных растений (Дынное дерево— Caricapapaya L., Канавалия— Canavalia ensimoformis (L.) DC.)Ферменты присутствуют во всех живых клетках и играют важнейшую роль во всехпроцессах жизнедеятельности.В клетке фермент может находиться:1)В свободном виде2)Перисферический белок (фермент) – слабо присоединен к мембране3)Интегральный – сильно взаимодействует с мембранойКроме того, некоторые ферменты имеют «якоря», позволяющие им находиться и вмембране и в цитоплазме.3.Биосинтез ферментов.

Посттрансляционная модификация. Сборка ферментов.Кофакторы и простетические группы.51Биосинтез белка — сложный многостадийный процесс синтеза полипептиднойцепи из аминокислотных остатков, происходящий на рибосомах клеток живых организмовс участием молекул мРНК и тРНК.Биосинтез белка можно разделить настадии транскрипции, процессинга и трансляции. Во время транскрипции происходитсчитывание генетической информации, зашифрованной в молекулах ДНК, и запись этойинформации в молекулы иРНК. В ходе ряда последовательных стадий процессинга изиРНК удаляются некоторые фрагменты, ненужные в последующих стадиях, и происходитредактирование нуклеотидных последовательностей.

Характеристики

Список файлов лекций