Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Масса димера 95 кДа. Для определения локализации и ориентации белка полосы 3 использовали следующий прием; интактные эритроциты, разорванные тени и вывернутые наружу мембранные везикулы подвергали протеолитическому действию химотрипсина. Результат протеолиза зависел от того, что было доступно действию химотрипсина: наружная или внутренняя поверхность мембран или же обе поверхности сразу.
Эти опыты показали, что белок полосы 3 локализован на обеих сторонах эритроцитарной мембраны и все молекулы белка одинаково ариентировины (рис. 10.23), Оказалось также, что углеводный компонент белка расположен на наружной поверхности. Трансмембранная локализация белка полосы 3 вполне Рис. 10.21.
Электрофоретическое разделение белков эрнтроцитариой мембраны на ДСН-полнакриламндном геле. Краситель кумасси синий. (Печатается с любезного разрешения д-ра 'т'. Маге)>еэй) соответствует его функции канала через мембрану. Еше один хорошо изученный трансмембранный белок эритроцитов-это гликофорин А, состоящий из 16 олигосахаридных единиц, прикрепленных к единственной полнпептидной цепи. На долю углеводов приходится 60;> массы этого белка, так что его название (образованное от греческого «нести сахаре) вполне заслуженно.
Из-за высокого содержания углеволов гликофорнн интенсивно окрашивается РАЯ-реактивом. 10. Введение в проблему биологических мембран 213 в плазматических мембранах локализованы талзка на наружной стороне мембраны (рис. 10.25). Возможно что углеводные группы служат для ориентирования гликопротеинов в мембране.
Обладая ярко выраженными гидрофильными свойствми, остатки сахаров в гликопротеинах или гликолипндах должны располагаться на поверхности мембраны, а не в ее углеводородной сердцевине. Энергетическая цена встраивания олигосахартщной цепи в углеводородное окружение внутри мембраны очень высока. Стало быть, существует барьер, препятствующий свободному вращению гликопротеина от одной стороны мембраны к другой. Угле- водные компоненты мембранных гликопротеинов способствуют поддержанию асимметрии биологических мембран. Углеволы на поверхности клетки могут играть также важную роль в межклеточном узнавании. От узнавания клетками друг друга зависят такие, например, процессы, как формирование тканей путем взаимодействия различных клеток илн распознавание чужеродных клеток иммунной системой высших организмов.
Углеводы обладают по- СН ОН Н тт' Н й.-с — СН вЂ” СН 2 О С вЂ” О Н Н Н вЂ” Н О=С сн, дт-ацетнкгпюкоземнн, присоединенный к остатку есперетнне СН ОН вЂ” сн,— сн С= — О Н Н вЂ” Н О=С сн М-ацетнпгзпактозамнн, присоединенный к остатку верина Угяееоднея единица Рис.
10.23. Схема расположения белка полосы 3 (анионный канал) в мембране эритроцита. 1%е(пвге1п К. К, К)забадав Ю.К., Бтес)г Т.1., 1. Яиргашо1. Ягиссиге, 8, 325 (1978).1 тенциальной возможностью к созданию огромного структурного разнообразия. Так, набор углеводов на поверхности клеток имеет колоссальное число вариантов потому, что: 1) моносахариды могут соединяться друг с другом через любой из своих гидроксилов; 2) связь по С-1 может быть как еч так и р-конфигурации и 3) возможно интенсивное ветвление цепи.
В самом деле, из четырех сахаров может образоваться гораздо больше разных олигосахаров, чем из четырех аминокислот — разных олигопептидов. 10.13. Липнды н многие мембранные белки быстро днффунднруют в плоскестн мембраны Биологические мембраны — зто не застывшие структуры. Напротив, и липиды, н многие белки мембран постоянно перемешаются в латеральном направлении. Быстрое движение белков мембраны выявляется с помощью флуоресцентной микроскопии при следующей постановке опыта.
Культивируемые клетки человека и клетки мыши можно заставить слиться друг с другом; образующаяся при этом гибридная клетка называется гетерокарион. Одна часть плазматической мембраны гетерокарнона происходит из клетки мыши, а другая — из клетки человека. Остаются ли мембранные белки мыши и человека разделенными в ге- 1О. Введение в проблему биологических мембран 215 Снаружи Бнслои ьс Рнс. 10.24.
Оотетки оекере е гликолротеине Последовательность аминокислот и трансмембранная локализация гликофорина А из эритроцитов. 15 углеводных единиц, присоединенных к остаткам серина и треонина, показаны светло-зеленым, а одна углеводная единица, присоединенная к боковой цепи аспарагнна, †тем-зеленым. Гидрофобные аминокислотные остатки, погруженные в бислой, выделены желтым. С-концевая часть молекулы белка, расположенная внутри клетки, несет много отрицательно заряженных (красные) и положительно заряженных (синие) аминокислотных остатков. В числе угле- водных единиц в Х-концевой части белковой молекулы, лежащей вне клетки, много отрицательно заряженных групп опаловой кислоты.
(Печатается с любезного разрешения д-ра Ч. Магспея.) Часть ! 21б Конформации и линамика терокарионе или они смешиваются? Для ответа на этот вопрос использовали маркеры, а именно антитела с флуоресцентной меткой и далее визуально наблюдали за ними с помощью светового микроскопа. Антитело к мембранным белкам мыши имело зеленую флуоресценцию, а антитело к мембранным белкам человека — красную (рис. 10.26). В новообразованном гетерокарионе одна половина поверхности светилась зеленым, а другая — красным. Однако меньше чем через час (при 37'С) участки зеленой и красной флуоресценции полностью смешивались. Этот опыт показывает, что мембранный белок способен диффундиравать иа Вне клетки Оететки оекере е гликолилиае и Клеточное немерено Внутри «леткн Рис.
10.25. Углеводные остатки гликолипидов и гликопротеинов как правило, локализованы на наружной поверхности плазматических мембран клеток млекопитающих. Внутри СОО 5ЗО расстояние порядка нескольких микрон примерно за 1 мин. Более общий н количественный метод измерения латеральной диффузии мембранных компонентов в интактных клетках состоит в определении скорости восстановления флуоресцвнции после тушения (рис. 10.27).
Для этого определенный компонент на поверхности клетки специфически метят флуоресцентным хромофором и помещают небольшую часть поверхности клетки (- 3 мкм') в поле зрения флуоресцентного микроскопа. Далее, находящиеся в поле зрения флуоресцирующие молекулы разрушают мощным пучком лазерных лучей, После этого определяют время нового появления флуоресценции в поле зрения, используя только слабое освещение, чтобы избежать дополнительного тушения. Если меченый компонент подвижен, то обесцвеченные молекулы исчезнут из поля зрения, а их место займут флуоресцирующие молекулы; в итоге интенсивность флуоресценции в поле зрения возрастет. Скорость восстановления исходного уровня флуоресценцни зависит от латеральной подвижности флуоресцентно-меченого компонента, которую можно выразить через коэффициент диффузии Р.
Среднее расстояние л (см), пройденное по плоскости за время г (с), зависит от Р (см с ') в соответствии с уравнением 5 = (4Рг)555 55 665 Клетка человека Клетка мыии Слияние Гетерокарнон фуаия опько соа) Рис. 10.2б. Схематическое изображение слияния клетки мыши и клетки человека с последующей лиффузней мембранных компонентов в плоскости мембраны. Спустя несколько часов после слияния маркеры с зеленой и красной флуоресценцией полностью перемешиваются. 1О. Введение в проблему биологических мембран 217 Коэффициент диффузии липидов в различных мембранах составляет примерно 10 ' см.с '.Таким образом,молекула фосфолнпида диффундирует в среднем на расстояние 2.
!О а см, или 2 мкм, за 1 с. Это означает, что молекула лилида может леремгститься с одного конца бактериальной клетки на другой эа ! с. Экспериментально установленная величина коэффициента диффузии показывает, что вязкость мембран примерно в 100 раз выше вязкости воды и близка к вязкости оливкового масла. В отличие от липидов белки очень неоднородны в отношении латеральной подвижности. Некоторые белки почти так же подвижны, кан липиды, другие — практически неподвижны.
Так, фоторецепторный белок родопсин характеризуется очень высокой подвижностью: его коэффициент диффузии равен 4 10 ' см' с '. С другой стороны, фибронектин (периферический гликопротеин, участвующий во взаимодействии клетки с субстратом) имеет коэффициент диффузии Р менее 10 'г см с '. Малая подвюкность некоторых белков, возмохтно, объясняется тем, что они закреплены на субмембранных цитоплазматических структурах. туме Ворот яен ля » я ми о* ее е и ео »» хс к0 гуме»ив л Б В Рис. 10.27.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
