Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 57
Текст из файла (страница 57)
Таким образом, меибрины, выполняюзцие неодинаковые функции, различаются также по белковому составу. 10.8. Реконструкция функционирующих мембранных систем нз очищенных компонентов Большое множество мембранных белков было солюбилизировано и получено в очищенном виде (см. гл. 34 — 37). Некоторые из них сохраняют активность в растворе с детергентом.
Например, фоторецепторный белок родопсин лает одну и ту же полосу поглощения 500 нм независимо от того, находится лн он в растворе детергента или же в составе мембраны сетчатки. Более того, в обоих случаях простетическая группа этого белка при освещении претерпевает одинаковые структурные изменения. Белок саркоплазматического ретнкулума мышц калсеквестрин, связывающий кальций, сохраняет способность связывать кальций и вне мембраны.
Из саркоплазматического ретнкулума был выделен также кальциевый насос (фермент Са" -АТРаза). Оказалось, что из смеси фосфолипида и белка кальциевого насоса могут образоваться функционально активные пузырьки, способные накапливать Саз+ в присутствии АТР как источника энергии. Реконструкция Рнс. 10.16. Электрофореграммы различных мембран в ДСН-полнакриламндном геле. А -плазматическая мембрана эритроцнтов.
Б †мембранн диски палочек сетчатки.  †мембра саркоплазматнческого ретикулума мышечных клеток. [Печатается с любезного разрешения д-ра Т. 81ес)г (рис. А) н д-ра О. Мас1.еппап (рис. В).) 1О. Введение в проблему бно.югических мембран сн, Н,С вЂ” (СН,), — СН,— и' — СН, Вь СН, Бромнд додецилтриметнламмонил ЩТАБ) НС СН, НьС С СНт С О (СНь СНт О), Н н,с сй, Полноксиэтилан л.т.октнлфанол (серии тритона Х) СОО На' он изменении рН. Согласно последним данным, периферические белки мембран в большинстве случаев присоединяются к поверхности интегральных белков. Для того чтобы определить, локализован ли данный белок во внутренней части мембраны, используют главным образом электронно-микроскопический метод замораживания — скалывания.
Клетки или фрагменты мембраны быстро замораживают до температуры жьщкого азота, Замороженную мембрану раскалывают далее толчком ножа микротома. Скол обычно проходит продольно посередине бнслоя (рнс. 10.19). В результате раскрывается значительная область внутренней части лнпидного бнслоя. Далее эту ФФФФФ ФЭ б Ф ЭЭФ а ЭФЭФФЭЭ Рис. 10.18. сн, НьС (СНт)~ь СНт' и О СН, Додацилдиматиламиноксид (ДДАО, аммоникс (.О) НО' О Халат натрии Рис. 10.17. Структуры детергентов, используемых для солюбилизации н очистки мембранных белков. функционально активных мембранных систем из очищенных компонентов — наделений подход к изучению мембрант<ых процессов. 10.9.
От.дельные белки мембран глубоко погружены в лнпидный бислой Некоторые мембранные белки удается выделить методами мягкой обработки, например экстрагированнем раствором высокой ионной силы (напрнмер, 1 М )ч(аС1). Другие белки оказываются более прочно связанными с мембраной — нх можно отделить лишь с помощью детергента (рис. 10.17) или органического растворителя. Исходя из различий в прочности связи с мембраной, соответствующие белки подразделяют на периферические и интегральные (рис. 10.18). Интегральные белки образуют многочисленные связи с углеводородными цепями мембранных липидов, н потому их можно выделить только с помощью агентов, конкурентно участвующих в этих неполярных взаимодействиях.
Периферические белки, напротив, связаны с мембранами электростатическими силами и водородными связями. Эти полярные взаимодействия могут быть разрушены при добавлении солей или Часп ! 210 Конформации и динамика Интегральные белки (а, б, в) мембраны образуют большое число связей с углеводородными цепями бислоя. Периферические мембранные белки (г) присоединяются к поверхности интегральных белков.
носительно инертной мембраны, функцио- нирующей главным образом в качестве изолирующей поверхности. Рнс. 10.19. Электронно-микроскопический метод замораживания — скалывания. Плоскость скола проходит посередине мембраны бислоя. 1э(пйег 8.1., Нозр. Ргас!., 8, 8! (1973).1 обнажившуюся поверхность покрывают путем напыления слоем угля или платины, что дает реплику внутренней части бислоя.
Для изучения наружной поверхности мембраны метод замораживания †скалыван используют в сочетании с методом глубокого травления. При этом сначала путем скола обнажают внутреннюю часть замороженной мембраны. Далее высушивают лед на прилежащей поверхности мембраны — это метод глубокого травления. Сочетание двух методов, называемое электронной микроскопией с применением замораживания— травления, позволяет получить картину внутренней части мембраны и обеих ее поверхностей. Достоинство рассматриваемого подхода состоит в том, что он не требует фиксации и обезвоживания биологического материала. В исследованиях методом замораживания — травления было непосредственно доказано присутствие интегральных белков во многих биологических мембранах.
Например, в мембране эритроцита содержатся глобулярные частицы высокой плотности диаметром около 75 А (рис. 10.20). Большое число глобулярных частиц имеется также внутри мембраны саркоплазматического ретикулума. В отличие от этого искусственный бнслой из фосфатиднлхолина имеет совершенно гладкую поверхность скола.
Оказались большей частью гладкими и поверхности скола миелиновой мембраны, что и следовало ожидать от этой от- 1О. Введение в проблему биологических мембран 211 10.10. В мембране эрнтроцнтов содержатся различные периферические н интегральные белки В работах по изучению мембран эритроциты оказались наилучшим объектом исследований, поскольку они легко доступны и относительно просто устроены. Будучи лишены органелл, эритроциты имеют только одну мембрану — плазматическую. Путем осмотического лизиса можно получить тени эритроцитов, т.е. чистые плазматические мембраны, без цитоплазмы. На рис. 10.21 показаны результаты электрофоретического разделения белков такого мембранного препарата на полиакриламндном геле, содержащем ДСН. При окрашивании кумасси синим проявляется более десяти полос.
Основные полосы пронумерованы и обозначаются как полосы 1, 2, 3, 4.1, 4.2, 5 и 6 (рис. 10.21). При окрашивании иодной кислотой — реактивом Шиффа (РАБ-реакция)' выявляется несколько белковых фракций, богатых углеводами. Эти полосы обозначаются соответственно РАБ-1, РАЯ-2, РАБ-3 и РАЯ-4. Где локализуются рассматриваемые белки в мембране эритроцита7 Белки, соответствующие полосам 1, 2, 4.1, 4.2, 5 и 6, экстрагируются из мембран при повышении ионной силы раствора или изменений рН; следовательно, они расположены на периферии мембраны. Кроме того, на них не оказывает влияния инкубация интактных клеток или запаянных теней с различными протеолитическими ферментами. В то же время эти белки полностью расщепляются при обработке протеазами разорванных теней.
Отсюда можно заключить, что эти периферические белки находятся па иитоплазматической стороне мембраны эритраиюиав. Полоса 6 — это фермент гликолиза глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназа (разд. 12.5), полоса 5 — актин, необходимый ' В отечественной литературе вместо сокращения ИКШ нередко употребляется более благозвучное ШИК, однако оно не соответствует сути, поскольку обработка водной кислотой предшествует обработке реактивом Шиффа. Псотому мы будем пользоватъся распространенным сокращением латинскими буквами РА8 (Репой!с ас!д-ЯсГйй' геайеп!).— Прим.
перев. Рис. 10.20. Электронная микрофотография плазматической мембраны эритроцита, полученная с применением метода замораживания-травления. Внутренняя часть мембраны, обнажившаяся при сколе, богата глобу- лярными частицами диаметром около 75 А. Эти частицы — интегральные белки мембраны.
(Печатается с любезного разрешения д-ра У. Магспезь) Часть 1 212 Конформации и динамика для мышечного сокрашения и обеспечивающий клеточную подвижность (разд. 34.1). Полосы 1 и 2 — слектрин, цепи которого, соединяясть образуют разветвленную волокнистую сеть. Вместе с другими белками спектрнн, по-видимому, стабилизирует и регулирует форму мембраны эритроцитов, изменяющуюся при прохождении клеток через мелкие кровеносные сосуды (рис. 10.22). Кроме того, эритроциты подвергаются сильному механическому сдавливанию при проталкивании крови сердцем. Что касается полос 3 и 7 и всех четырех полос, окрашивающихся РАЯ-реактивом, то их можно отделить от мембраны эритроцита только с помощью детергентов или органических растворителей. Следовательно, эти полосы представлены интегральными белками мембраны.
Такой вывод подтверждается результатами электронно-микроскопического исследования; методом замораживания-скалывання (рис 10.20) было показано, что часть белков эритропита погружена в глубь углеводородной области мембраны. Полоса сс.Цепь спектриие Р-Цепь слектриие Аииоииыд канал 4,1 4,2 ь б ' ОаВИВВВЮ Актин 6 чвяяаявВВ гличерельдегид Фосфет.
дегидрогеиюе 10.11. Мембрану эритроцита пронизывают канал для аняонов и сложный белок гликофорин В мембране эритроцитов имеется анионный канал, делающий мембрану проницаемой для НСОэ и СГ. Быстрый обмен этих ионов через мембрану имеет большое значение для транспорта СО эритроцитами. Как было показано относительно недавно, анионный канал — это димер белка, представленного лри электрофореэе лолосг>й 3; он составляет одну четверть общего количества белка в эритроцитарной мембране.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
