Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 2
Текст из файла (страница 2)
нальные работы, представляющие интерес с исторической точки зрения. Примеры для иллюстраций были взяты мной в основном из картотеки Лаборатории молекулярной биологии Медицинского научно-исследовательского совета, поскольку они как правило весьма убедительны. В связи с этим мне хотелось бы выразить свою признательность А. Лентон за иллюстративный материал, подготовленный ею специально для меня, а такжедля других сотрудников, чем я беззастенчиво воспользовался. Я особенно благодарен У. Дженксу, Г.Диксону, Р. Гутфройнду, К.
Типтону и Р. Малвею за критические замечания, относящиеся к рукописи в целом, а также М. Перутцу и Д. Блоу за их комментарии к отдельным главам. Кроме того, я хочу поблагодарить Королевское общество, Американское химическое общество, издательства Корнельского университета, «Академик пресс», Дж. Уайли, а также Элана Р. Лисса за разрешение воспользоваться иллюстрациями. Э.
Фершт Глава ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ В 1930 г. вышла книга Холдейна о ферментах [1[, прочесть которую стоит и сегодня. Более всего в этой книге меня поразило несоответствие между обширностью для того времени знаний о свойствах и действии ферментов и их ограниченностью в отно.
шенин химической природы ферментов: вопрос о том, являются ли ферменты белками, все еще широко дискутировался. Такая односторонность была обусловлена отсутствием методов, позволяющих проводить прямое исследование ферментов. Вся информация носила косвенный характер — ее источником служили опыты по действию ферментов на соответствующие субстраты. Тем не менее уже спустя немногим более 30 лет после получения Бухнером в 1897 г.
бесклеточного экстракта ферментов были заложены основы современной ферментативной стационарной кинетики. Для дальнейшего развития энзимологии необходимо было получить очищенные ферменты в количествах, сравнимых с количеством субстратов, и непосредственно исследовать их. Первые шаги в этом направлении сделал в 1926 г. Самнер, которому удалось получить кристаллы уреазы, выделенной из экстрактов канавалии мечевидной. Вскоре (1930 †19 гг.) Нортроп и Кунитц закристаллизовали пепсин, трипсин и химотрипсин. Полученные факты позволили, наконец, доказать, что ферменты являются белками, и дали возможность разработать методы современной химии белка, определить аминокислотную последова.
тельность (Сэнджер), установить трехмерную структуру молекул белков в растворе (Перутц и Кендрью), применить методы исследования кинетики быстрых реакций (работы, начатые Роутоном в !923 г.). Основная часть данной монографии посвящена прямым исследованиям ферментов, выполненным уже после того, как вышла в свет книга Холдейна [1]. В этой главе мы остановимся на наиболее значительном достижении в изучении ферментов— установлении их трехмерной структуры. Кроме того, здесь же вкратце будет рассмотрена структура лизоцима и сериновых протеиназ, поскольку работы, связанные с экспериментальным и ГЛАВА ! теоретическим исследованием этих ферментов, обсуждаются в последуюгцих главах. В гл.
!2 рассматриваются структура и механизм действия отдельных ферментов. А. Первичная структура белков Остовом белковой молекулы является неразветвленная полипептидная цепь из ! -а.аминокислот, которые связаны друг с — — М-цепь ы ин на 5 т!лг г ы ь, г г а ы сг! г Р гх Рис. 1.1.
Пераичиан структура а-химотрипсина. Фермент состоит из трех цепей, санзаииых друг с другом дисульфидиыми мостиками. Эти цепи образааались нз одной полипептидной цепи хнмотрипсиногеиа а результате ныгдеп. ленин амннокислотных остаткоз Бер-13, Агя-!4, Тйг-147 и Азп-!48. (С любез- ного разреглеииа В1огч Ь. М.) ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ !3 Таблица ! Осяоаиые аминокислоты (ЙСН((г(Н') СО9) РК, '1 Бокован пень, И 2,35; 9,78 2,35; 9,87 2,29; 9,74 Н— СН— Глипии (О!у, О, 75) Алании (А!а, А, 89) СН СН— СН Валин (Ча!, Ч, 117) СНз СНСНз СНз 2,33; 9,74 Лейцин (Веп, 1., 131) СН СН СН— СН, 2,32; 9,76 Изолейции (1)е, 1, !31) (Гс )( сн но-© — снг 2,16' 9,18 2,20; 9,11; 10,13 Тирозии (Туг, У, 181) 2,43; 9,44 1 ! 2,19; 9,21 2,09; 9,11 НОСН НО СН— СН НВСН— СНз5СНзСНз НзНС (-О) СН, Нзкгс( 0)СНзСНт— Оасснз— Серии (Зег, 8, 106) Треоиии (Т)гг, Т, 1!9) Цистеии (Суз, С, 121) Метионии (Ме(, М. 149) Аспарагии (Азп, !ч, 132) Глутамии (0)п, 0, 146) Аспарагииоаан кислота мг,с,~и) ЕП(оц О.
С., ЕП(о(Г ИГ. Н., успев К. очанка Оа(а (ог Москвой(са( гевеагсЬ, Оамвоп и. М. С., М., Ох1ога Оп(тегвиу Рвем 09691. Амннокнсаота (трех н однобук- венвме обозначеннк, моа, вес) Феиилалаиии (Рйе, Р, 165) Триптофаи (Тгр, %, 204) 1,92; 8,35, 10,46 2,13; 9,28 2,1; 8,84 2,17; 9,13 1,99; 3,90; 9,90 ГЛАВА ! Продолжение Аминокислота !трек- и олнобгк- венные обовнвнсния, мол. вес) „к,а) Боковая цепь, Н О ССН СН— 2,10; 407; 947 2,16; 9,18; 10,79 1,82; 8,99; 12,48 Глутзмнновая кислота (О1о, Н, 147) Лизни (Ьув, К, 146) Н М+(Снг)с— Нт Мь ,) ' С вЂ” Мы(СНг)в— Нтн Ар гн ни н (Агя, й, ! 74) ( )~-сн, Д Гнстнлнн (Ннь Н, !55) 1,80; 6,04; 9,33 1,95; 10,64 Пролив (Рго, Р, 115) Нг О О О О Нг!4СНС вЂ” !хнснс — !ЧНСНС вЂ” !хнснс — Хн— 1 ! ! ! Й1 Йс Йв Йс (1.1) Почти все внутриклеточные белки — зто линейные полипептидные молекулы, многие же внеклеточные белки содержат ковалентные поперечные ( — Я вЂ” Я вЂ” )-мостики, образованные тиоловыми группами двух остатков цистеина.
Эти мостики находятся либо в пределах одной цепи (и тогда в главной полипептидной цепи возникают петли), либо связывают разные цепи (рис. !.1). В последнем случае из одноцепочечного предшественника в результате протеолитического расщепления формируются многоцепочечные структуры. Примером такого рода может служить образование инсулина из проинсулина и химотрипсина из химотрипсиногена.
При восстановлении тиолами другом амидными связями; последние образуются а-карбоксильной группой одного остатка и а-аминогруппой соседнего. Обычно белки состоят только из 20 перечисленных в табл. 1 1 аминокислот. Первичная структура белковой молекулы— это последовательность, в которой аминокислоты соединяются друг с другом, образуя биополимер. По договоренности зта последовательность записывается, начиная с Х-конца цепи: и ехмвгнхя стгзктзгх фагмвнтов гб дисульфидные мостики разрываются.
Интересно, что отдельные полипептидные цепи часто можно восстановить и денатурировать, а затем вновь обратимо окислить и ренатурировать, в то время как восстановление и денатурация белков, образовавшихся из предшественников путем химической модификации последних, обычно носит необратимый характер. Способность отдельных полипептидных цепей к самопроизвольной укладке позволяет сделать важный вывод: трехмерная структура белка определяется генетически детермируемой аминокислотной последовательностью, Б.
Трехмерная структура ферментов 1. Рентгеноструктурный анализ Значение рентгеноструктурного анализа в энзимологии, пожалуй, невозможно переоценить. Этот метод не только стал экспериментальной основой, позволившей получить все известные к настоящему времени данные о структуре белков, но и оказался наиболее ценным методом исследования механизмов ферментативного катализа. В этом разделе мы вкратце рассмотрим, какую информацию позволяют получить рентгеноструктурные исследования белков. Рентгеновские лучи рассеиваются на электронах атомов аналогично тому, как рассеиваются световые волны, падающие на дифракционную решетку. Для монохроматического пучка рентгеновских лучей регулярная решетка кристалла играет роль трехмерной дифракционной решетки, дающей рефлексы в тех местах, где происходит усиление рассеянных лучей в результате интерференции.
Структуру кристалла, или, точнее говоря, распределение электронной плотности, можно определить по рент. генограмме с помощью преобразования Фурье. Для этого необходимо знать интенсивность и направление дифрагированных лучей (что легко определить на фотопленке либо по распределению рефлексов, либо с помощью дифрактометра), а также их фазы. Определение фазы каждого рефлекса (главное условие при использовании преобразования Фурье) — наиболее трудная задача.
Способ ее решения, разработанный для случая простых кристаллов, непригоден при установлении структуры белков. Проблема фаз была преградой на пути развития кристаллографии белков до тех пор, пока в 1954 г. Перутц и др. (2) не разработали метод изоморфноео замещения, основанный на включении в определенные участки молекул белка тяжелых атомов без нарушения кристаллической структуры белка и его упаковки. Атомы металлов рассеивают рентгеновские лучи сильнее ГЛАВА 1 10 атомов белка и изменяют интенсивность дифрагироваиных лучей. Из изменения интенсивности, которая может как увеличиваться, так и уменьшаться в результатерассеянияна тяжелых атомах, удается определить фазу дифрагированных иа белке лучей.
Для точного определения фаз необходимоиметьиесколько различных изоморфных производных. После определения фаз и амплитуд всех дифрагированных лучей рассчитывают электронную плотностьбелковой молекулы. Затем в соответствии с рассчитанной электронной плотностью из проволочных моделей аминокислотных остатков строят при. ближенную модель молекулы белка, которую впоследствии уточняют с помощью ЭВМ. Точность и разрешение Получаемая точность определяется качеством экспериментальных данных и разреилением. Смысл термина «разрешение» лучше всего иллюстрируется данными табл. 1.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
