Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 6
Текст из файла (страница 6)
1. Методы исследования фермент-субстратиых комплексов а. Разностный Фурье-метод Обычно белковые кристаллы содержат около 50'/, растворителя, иногда эта величина уменьшается до ЗОЪ, но никогда не бывает меньше. Нередко в кристаллах имеются заполненные Растворителем каналы, которые идут от поверхности образца к активному центру; по ним субстраты могут диффундировать внутрь кристаллов и связываться с ферментом. Часто проводят сокрнсталлизацию фермента с субстратами. Разностный Фурье- ГЛАВА ! метод позволяет установить структуру комплекса в том случае, когда связывание лиганда не сопровождается сильными изменениями в структуре или упаковке молекул фермента в кристалле. Этот метод состоит в выявлении различий между рентгенограммами исходных кристаллов белка и этих же кристаллов, пропитанных раствором лиганда.
Электронную плотность молекулы связанного лиганда и любые незначительные изменения в структуре фермента можно определить, не устанавливая полную структуру комплекса. б. Получение стабильных комплексов Отправным пунктом в первых опытах по определению структуры фермент-субстратного комплекса, в котором субстрат связан продуктивно, была структура стабильных комплексов между ферментом и ингибитором, Классическим примером такого рода является установление структуры лизоцима (см.коиец данной главы). Указанный подход можно реализовать несколькими способами.
Например, можно связать определенную часть молекулы субстрата с ферментом и установить структуру остальной части путем построения модели. Другой способ состоит в использовании не способного к ферментативному преврашению аналога субстрата, в котором модифицирована реакционноспособная связь. Показательным примером применения подобного подхода может служить связывание рибонуклеазой фос оната вместо фосфата (гл. 12, равд. В). ногда удается прямо исследовать реакционноспособный фермент-субстратный комплекс в условиях, при которых ферментативная реакция не протекает. Эти приемы основаны на использовании медленно реагируюших субстратов при рН, когда фермент почти полностью инактивирован в результате перехода остатка каталитического центра в другое ионное состояние (см. индолилакрилоилхимотрипсин), или при очень низких температурах (ацильное производное эластазы; см. ниже), либо на использовании химически модифицированного фермента.
Примером химической модификации является восстановление кар. боксильной группы важного в каталитнческом отношении остатка Азр-52 лизоцима до спиртовой группы (см. ниже и гл, 12, равд. Д). Иногда удается прямо исследовать реакционноспособный фермент-субстратный комплекс при быстром протекании реакции. Эта возможность реализуется в тех случаях, когда между субстратом и продуктом устанавливается равновесие, смешенное в сторону образования субстрата.
Добавление к равновесной смеси фермента не может изменить положение равновесия в растворе, в результате чего удается получить стабильный фер- ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ мент-субстратный комплекс. Однако нет никакой уверенности в том, что положение равновесия, имеющее место в растворе, остается прежним для связанных с ферментом реагентов (гл 3) Примером такого равновесия служит гидролиз дипептида, предпочтительный синтез которого можно стимулировать введением избытка амина [44, 45]: КСОМНК КСО,, + Н++ К МН (1. 4) Этот подход был использован также в опытах с применением ЯМР-спектроскопии [46]. Другим примером является связывание диоксиацетонфосфата триозофосфатизомеразой (гл.
12, разд. Ж.1). Этот фермент еатализирует изомеризацию одного реагента в другой; устанавлнвающееся равновесие сдвинуто в сторону образования одной из форм. Напомним, что для обратной реакции комплекс фермент †проду является фермент-субстратным комплексом. Примеры применения всех этих подходов обсуждаются в гл. 12. Ниже несколько более подробно рассмотрены сериновые протеазы и лизоцим. Эти ферменты сыграли важную роль в развитии обсуждаемых здесь идей и методов и часто упоминаются в данной книге. 2. Пример 1: сернновые протеазы Пептиды и синтетические сложные эфиры гидролизуются сериновыми протеазами с образованием в качестве промежуточного продукта ацилфермента [47]: Š— ОН+ КСОМНК' ~ Š— ОН КСОМНК' О ч=ь Š— Π— С вЂ” К ч=ь Š— ОСОК ч=~ Š— ОН ° КСО Н 1 + МНК' МН,К п — он+ Ксо,н (1.5) Сначала в результате атаки субстрата гидроксилом Зсг-195 образуется нековалентно связанное промежуточное соединение, превращающееся в геграздрическое промежуточное соединение.
Затем это соединение распадается с образованием анилфермента с высвобождением амина или спирта. Далее происходит гидролиз ацилфермента и образование комплекса фермент — продукт. Кристаллографические исследования позволили установить структуру большинства из этих комплексов, главк г зв Структура остальных может быть получена путем построения моделей. Двигаясь в обратном направлении, от «фермент-продуктного» комплекса к фермент-субстратному, Стейц и др.
[48[ установили структуру комплекса химотрипсина с продуктом— рнс. 1.14. Ленточная днаграмма полнпептндноа непн соевого ннгнбнтора трнпснна. Зачерненные участки — областн контакта с ферментом. [В!очг Р.М., бап1п 1., СЬо11а С., 1ча1пге, 1опб., 249, 54 (1974).1 Х-формил-1.-триптофаном. Авторы использовали диффузию продукта внутрь кристаллического фермента с последующим применением разностного Фурье-метода. Структуру неспецифичного ацилфермента, индолилакрилонлхимотрипсина, опреде- ляли при рН 4, когда деацилирование комплекса происходит очень медленно [49[.
Субстрат, активированное производное кислоты — индолилакрилоилимидазол, диффундировал в кри- ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ ЗВ а. Центр связывания «Центр связывания» полипептидного субстрата состоит из ряда подцентров, расположенных по поверхности фермента. Эти подцентры обозначаются так, как показано на схеме (1.6). Ами. нокислотные остатки полицептидного субстрата обозначаются буквой Р, а подцентры — буквой 5. Если не считать первичного подцентра Эн связывающего боковые цепи ароматических субстратов химотрипсина или оснбвных аминокислотныхсубстратов трипсина, в сериновых протеазах нет никаких явно выраженных складок или желобков, которые предназначались бы для связывания субстрата. 6 6, 8', ~о,о У Р Ф Ф О хн 1ЧН СНС вЂ” 1ЧНСНС вЂ” 1ЧНСНС вЂ” 1ЧН— ! 1, к, к к (1.6) Р, Р[ Ре СНС вЂ” ЫНСНС-1ЧНСНС! ! ! цз ~2 Ыл Р, Раск1елление сталл, где ацилировал 5ег-195.
Структурукарбобензоксиаланилэластазы определяли прн температуре — 55'С [50, 51[. Природа предоставила нам редкую возможность установить структуру фермент-субстратных комплексов трипсина и химотрнпсина с полипептидами, создав множество ингибиторов-полппептидов, которые очень прочно связываются с трипсином и химотрипсином, поскольку зафиксированы в той конформации, которую субстрат принимает при связывании [52[. Эти полипептиды не гидролизуются при физиологических условиях, так как подвижность аминогруппы, которая высвобождается при расщеплении пептида, ограничена и она не может диффундировать из активного центра фермента.
При устранении ограничений в панкреатическом ингибиторе трипсина путем восстановления дисульфидного мостика в полипептидной цепи пептидная связь между Еуз-15 и А!а-16 легко расщепляется трипсином [53]. Структура трипсина, его комплекса с оснбвным панкреатическим ингибитором трипсина и свободного ингибитора была установлена при разрешении 1,4, 1,9 и 1,7 А соответственно [54].
Полученные данные относятся к числу наиболее точных — положение атомов известно с точностью 0,1 — 0,2 А. Эти и другие исследования дали следующую информацию относительно связывания субстратов [55 — 65]. ГЛАВА 1 40 б. Первичный подцентр связывания (8~) Карман, связывающий ароматические боковые цепи специфических субстратов химотрипсина, представляет собой четко выраженную впадину глубиной !Π— 12 А, имеющую в поперечном сечении размеры 3,5 — 4А на 5,5 — 6,5А [48].
Эти параметры точно соответствуют размерам ароматического кольца, ширина которого составляет 6 А, а толщина — 3,5А. Диаметр метиленовой группы равен 4А (гл. 9), так что боковые цепи лизина или лгуну НМ г-с, , .:.. ---с(а(ау-грг) О-- '; "--с /Дгаоб ', (Сбг-4З) -8" — — Н С 7 / ', 'ф, о — —,,мн (бйнбт) 14-' Сй, (баг'-урб у Хр-/б Рнс. 1.16. Схематическое изображение участка свявыва. ння уходяшей группы в хнмотрнпсние, полученное с помощью подгонки модели нигябнтора паикреатнческого тряпсниа к структуре фермента 1661.
аргинина прочно связываются аналогичной по формевпадинойв молекуле трипсина. Как указывалось в равд. В.1, а трипсине на дне такого кармана имеется карбоксильная группа, предназначенная для связывания положительного заряда на конце боковой цепи субстрата, а в зластазе вход в карман частично блоки. рован. Карман, связывающий субстрат в химотрипсине, можно назвать «гидрофобным карманом», поскольку он образован неполярными боковыми цепями аминокислот.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
