Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Эти цепи создают подходящую среду, необходимую для связывания неполярных или гидрофобных боковых цепей субстратов. Физическая природа и прочность гидрофобных сил обсуждаются в гл. 9. Участок гидрофобного связывания в субтилизине представляет собой не столь четко выраженную впадину, как у панкреатических ферментов; он больше похож на неглубокую выемку. ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ 41 Образование же водородных связей характерно в равной степени для всех ферментов (рис.
1.12). Участок связывания реакционноспособного кислорода карбонильной группы локализован на полипептидном остове между !!Н-группами Зег-195 и О!у-195. Образующиеся здесь водородные связи имеют большое значение, поскольку кислород в процессе реакции приобретает отрицательный заряд.
Водородная связь имеется также между МН-группой И-ациламинового фрагмента субстрата и С=О-группой Ьег-214. в. Подцентры Ьь Вг Вз Водородная связь между ИН-группой )М-ациламинового фрагмента субстрата и карбонильной группой Вег-214 является началом непротяженной области, имеющей антипараллельную !1-структуру, которая образована аминокислотными остатками 5ег-214, Тгр-2!5 и О!у-216 фермента и остатками Рь Ре и Рз субстрата О Из Н И4 О И~ !! ! ! ! !! ! — С вЂ” М вЂ” СН вЂ” С вЂ” М вЂ” СН вЂ” С вЂ” М вЂ” СН— Н О Н О Н О !! — М вЂ” С вЂ” СН вЂ” М вЂ” С вЂ” СН вЂ” М вЂ” С вЂ” СН вЂ” М— ! ! ! ! ! ! Н Н О И Н И' Н О1у-21Е Тгр-215 Бег-214 Р г. Подцентр 81 — участок связывания уходящей группы Строение подцентра связывания уходящей группы соответствует конформации (..аминокислот [65].
Взаимодействие с ферментом носит в основном гидрофобный характер, что обусловливает отсутствие экзонуклеазной активности фермента; для проявления последней требуется связывание ионизированной карбоксильной группы в неполярной области (рис. 1.15). («Уходящая группа> — жаргонное выражение, относящееся к замещаемой группе в молекуле, в данном случае в ацильной группе.) 3. Пример 2: лизоцим Лизоцим катализирует гидролиз полисахарида, являющегося основным компонентом клеточной стенки некоторых бактерий. Этот полимер состоит из чередующихся единиц М-ацетилглюко- ГЛЛВЛ 1 42 Расы(аллен на СН,ОН СН,ОН ~ СН,ОН СН,ОН О О О вЂ” О о он, о оп,о он, о он о. НН СО 1 СН, НН СО СНЗ НН СО СН3 НН СО СН, (14аа) ()4ДМ) (1ЧДО) (14ДМ) Й СНз СН СООН Рнс.
1.16. Полисахаридный субстрат лиаонима, обнаруженный в клеточных стенках бактерий. лизоцима послужило стимулом к исследованию белков в растворе. Кроме того, определение кристаллической структуры исходного фермента и его комплексов с ингибиторами пролили свет на неизвестный ранее механизм действия этого фермента. В отличие от химотрипсина лизоцим имеет четко выраженную глубокую впадину для связывания субстрата, простирающуюся вдоль одного края молекулы, которая имеет форму эллипсоида. Эта впадина частично образована неполярными боковыми цепями аминокислот, обеспечивающими связывание не- полярных областей субстрата, и, кроме того, имеет участки связывания ациламиновых и гидроксильных групп с помощью водородных связей.
В этой впадине располагается шесть участков связывания субстрата, обозначаемых через А, В, С, 1), Е и Р. Остатки ХАМ могут связываться только на участках В, 0 и Р, тогда как остатки )х)АО синтетических субе. ратов — на всех частках. Расщепляемая связь располагается между участками и Е. Ввиду отсутствия природных ингибиторов определить структуру продуктивного фермент-субстратного комплекса таким же способом, каким это было сделано в случае хнмотрипсина и трипсина, пока не представляется возможным. Ис- замина ()х)АО) и )х)-ацетилмурамовой кислоты (г)АМ), связанных р(1-+ 4)-связями (рис.
1.16). Установление структуры лизоцима — это одно из выдающихся достижений рентгеноструктурного анализа 166 — 68). Если определение структуры кристаллов сериновых протеаз явилось кульминационной точкой многолетних исследований, проходящих через всю историю энзимологии, то выяснение структуры малоизвестного фермента ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ 43 пользуемый в настоящее время метод основан на построении моделей. С его помощью установлена структура фермента и комплекса фермента с ингнбитором (ЫАСг)в (67).
Это соединение является плохим субстратом для данного фермента — структурные исследования показали, что он связывается непродуктивно на участках А, В, С, минуя участки () и Е, где происходит расщепление связи. Структура продуктивного комплекса была установлена посредством построения проволочной модели комплекса (Ь(АС)з с ферментом, а также удлинения полисахаридной цепи путем дальнейшего наращивания структурных единиц )чАСг; при этом использовались интуитивные представления о возможных местах связывания этой цепи с ферментом.
В настоящее время такая работа выполняется с использованием ЭВМ, позволяющих оптимизировать соответствие между ферментом и субстратом. Установлено, что расщепляемая связь располагается между карбоксильными группами 01п-Зб и Азр-52, которые находятся в неионизированном и ионизированном состояниях соответственно. Роль этих групп в расщеплении связей обсуждается в гл. 12.
В заключение отметим, что связывающие участки лизоцима и сериновых протеаз почти комплементарны субстратам: неполяр. ные участки субстрата контактируют с неполярными боковыми цепями аминокислот; участки субстрата, способные образовывать водородные связи, связываются с Ь)Н-группами полипептндного остова белка нли (как в случае лизоцима) с полярными боковыми цепями аминокислот, Благодаря этому подвергающаяся каталитическому превращению часть субстрата удерживается вблизи кислых, оснбвных или нуклеофильных групп фермента. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1.
На!дале А В. В., Епяутез, Ъопягпвпз, Огееп впд Со. (1930), М!Т Ргевв (1965) . 2. Отеел В. 97., !лэтит |тз Реги!я М. Р., Ргос. Н. 5ос., А225, 287 (1954). 3. Раиилк Л... Ма!иге о! 1Ье сЬеппсв! Ьопд, Сотне!1 1)твегвиу Ргезз (!960). 4. Ретяы А. К., Л. Агп, сЬегп, 5ос., 93, 3504 (1971), 5. Слои Р. У., Гаятал С. ЛЛ., В!осьетмбу, |3, 211, 222 (1974). 6 Уелэатасаа!ат С. М., В!оро!угпегз, 6, 1425 (1968). 7. Ееге!я Р.
АГ., Моталу Р. А., Всаетаеа Н. А., Ргос, пз|п, Асад, 5с!., 1). 5, А., 68, 2293 (!971). 8. Кил|г А О., Л. Ат. сЬепг, 5ос., 94, 4009 (1972). 9. Став(огд Л. Ь., Йрясоть П'. Аг., Зсвентап С. О., Ргос. пв1п Асад. Яс|., (Л, 5, А., 70, 538 (!973). 10 5ееЖ М., Сао|ыа С., Из|иге, 1.опд., 26|, 552 (1976). !1. Кил|г !. В., Л. Агп.
сЬегп. 5ос., 94, 8568 (1972). 12. Стмв Р. Н. С., Ас1в сг!з(в1(ояг., 6, 689 (1953). 13. С!юГЧа С., Л. гпо1ес, В!о1., 75, 295 (1973). 14. К!аррет М, Н., В!осыт. Ь!орЬув, Ас|в, 229, 557 (1971). 15. Кнгаатдя р. М., Л. то!ее. В!о1., 82, 1 (1974). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ бд, ЯЬобои О. М., 3тМ(е Ф, Х., 3тагеои Н, С., Со!д Ярбп3 НагЬ. Яувр. 9пап!.
В!о!., 36, 91 (1971). 60. ЯеВа( О. М., СоЬеи б. Н., Оао(ее О. В., Рогеегя Х. С., ВН(сок Р. Е., Со!д Ярг1пе НагЬ. Яутр, цпап1. В!о!., 36, 85 (1971). 61 Абае О., Ееоб 5., Ясбесубег Х,, Вет3ег А., РЕВЯ Ье!!., 11, 281 (1970). 62. бегбег А., Но(тапи Т„Сап. Х. В(осЬегп., 48, 384 (1970). 63. ТЬотреои В С., ВюсЬет!а!гу, 13, 5495 (1974). 64. Ваитапп (3!. Х(и В(теоеего 5. А., Ои!!ег Н., Епг. Х, ВюсЬегп., 39, 38! (1973). 65. РетеМ А.
В., ВЬгв О. М., Раеггее Х., В!осЬеги(а!гу 12, 2035 (1973). бб, В(аЬе С. С. Р., Х(оеига О. Ри Маб б. А., йотЬЬ А:'., С, Т., Руре О. С,, Яагта У. й., Ыв!пге, Ьопд„.206, 757 (1965). 67. РМЬЯрт О, С., Ргос. па1п. Асад. Яс(. (). Я. А., 57, 484 (1967) 68 В!аае С. С. Р., ХоЬпеаи Ь. Н., Ма!г б. А„Иог(Ь А. С, Т., РХВН!ре О. С., 5агта 1'. й., Ргос. В, Яос., В!67, 378 (1967). Глава ХИМИЧЕСКИИ КАТАЛИЗ Из структурных и кинетических исследований ферментов известно, что эти молекулы имеют определенные участки, связывающие субстраты, что иногда они образуют промежуточные соединения с ковалентными связями и содержат кислые, оснбвные и нуклеофильные группы.
В этой главе мы рассмотрим причины, по которым указанные особенности ферментов необходимы для катализа, и механизм их использования. Роль энергии фермент-субстратного связывания будет рассмотрена в гл. 10. В основе многих концепций катализа лежит теория переходного состояния. Поскольку даже поверхностное знакомство с этой теорией значительно упрощает понимание одних представлений и совершенно необходимо для понимания ряда других, мы рассмотрим ее основные положения и область применения. Затем мы обсудим основные принципы химического катализа и факторы, определяющие каталитическую эффективность ферментов, далее ознакомимся с наиболее развитыми областями кинетики и основами гомогенного катализа и прежде всего обсудим, какие факторы определяют реакционную способность молекул (что такое хорошая нуклеофильность и что такое хорошая уходящая группа для данной реакции); остановимся также на зависимости реакционной способности молекул от их структуры.
И наконец, для удобства попутно изложим некоторые сведения из области кинетики и стереохимии. А. Теория переходного состояния 11 — 4] Существует несколько теорий химической кинетики. Простейшая из них — теория столкновений, которая используется в гл. 4 для расчета констант скорости столкновения молекул в растворе. Более сложной является теория переходного состояния, особенно полезная при анализе зависимости реакционной способности молекул от их структуры. При этом процессы стол- химическии кдтдлт!3 41 кновения реагентов не рассматриваются: теория имеет дело только с самими реагентами (основное состояние) и с наиболее нестабильными соединениями, образующимися в ходе реакции (переходное состояние), Переходному состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакции (рис.
2.1); в этом состоянии химические связи Рис. 2.1, Переходному состоянию соответствует ма Лп ксимум, а промежуточному состоянию — минимум на кривой зависимости энергии от координаты реакции. Кир1инатла ргадт(нм непрерывно образуются и разрываются. Напротив, промежуточным соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на рассматриваемой кривой, Простой способ расчета скорости реакции основан на допущении, что между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие; в этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний. Общую скорость реакции получают затем умножением концентрации переходного комплекса на константу скорости его распада.
Расчет гораздо проще, чем кажется на первый взгляд, поскольку разность энергий между основным и переходным состояниями используется только качественно, и можно показать, что все переходные состояния при данной температуре распадаются с одинаковой частотой. Рассмотрим мономолекулярную реакцию.
Предположим, что разность энергий Гиббса для переходного (Хе) и основного (Х) ГЛАВА З 48 состояний равна Лб*. Воспользуемся хорошо известным соот- ношением равновесной термодинамики ' ~Х*1= [Х] ехр( — Ьбе/ЯТ). (2.1) где Ь вЂ” константа Больцмана, Ь вЂ” постоянная Планка.
При 25'С ч = 6,212 101з с-'. Следовательно, скорость распада молекул Х определяется уравнением — д [Х]/с(Г = т [ Х~1= = [Х] (ЬТ7Ь) ехр(- Ьбь[ГГТ), (2.3) (2.4) а константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна Ь1 — — (ЬТ)Ь) ех р ( — гдб~)1ГТ). (2.5) При необходимости энергия активации Гиббса Лбе может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие в соответствии с существующим в равновесной термодинамике соотношением Лб~ = ЬН* — Т ЬЯ4, (2.6) где ЬНт — энтальпия активации, а ЬЯе — энтропия актива. ции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
