Х.-Д. Якубке, Х. Ешкайт - Аминокислоты, пептиды, белки (1128686), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Непрерывный ряд полос находится в интервале2500 —3030 с м " 1 .Спектры ЯМР [34 — 38, 45]. 'Н-ЯМР-спектроскопические исследованияаминокислот показали, что химический сдвиг аминокислотных протонов, а6Ю1151I4ол\01s1204it /X1-6-2256Ю3245 265285Длина волны Л, нм11 11\\1\1\1\\3151IV2252\г\\»О А \\ \245265 285Длина волны Л, нм315Рис. 1-8. УФ-Спектры триптофана (в) и тирозина ( б ) в 0,1 н. НС1 (1) и0,1 н.
NaOH (2).Физико-химические свойства аминокислот36500023000 2500 2000345Волновое число, см *1500 1300 1100 1000 900 850 800 750 70065000 3000 2500 200078910а1Волновое число, см"1500 1300 110011121314м151000 900 850 800 750 7000.10.20,30,40.50,60.81.01.52345678б910 11 1213 14 16МРис. 1-9. ИК-спектры L-аланина (в) и L-аланингидрохлорида (б).также константы протон-протонного взаимодействия зависят от заряженного состояния молекулы.
В графическом изображении зависимость химического сдвига от pH имеет ^вид типичной кривой титрования. В качестверастворителей для ЯМР-спектроскопии аминокислот, пептидов и белковслужит обычно вода или D 2 O, а в качестве внутреннего стандарта применяют тетраметилсилан (ТМС), гексаметилдисилоксан (ГМДС) и 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат (ДСС).В случае 13С-ЯМР-спектроскопии [46, 47], которая применяется для выяснения строения неизвестных соединений и для аналитической характеристики простых производных аминокислот и пептидов, резонансные пикисвободных аминокислот (стандарт — TMQ лежат для карбоксильныхгрупп между - 1 6 8 и - 1 8 3 м. д., для а-углеродного атома между - 4 0 и37Аминокислоты+ г1 HgN-CH-COOI4C00Hдмсо/тч>-49,20 -39,70 -34,85Химический сдвиг 6, м.д.-171,55 -170,35128,9,10101з„-OOONH-CH-COOHIз сиI4СООС(СН()8-174,00 -170,75 -137.4 5 -127,60-155,45 -12835-79,30 -53,05-27,85-65,15 -39,60Химический сдвиг 6, м.д.Рис.
1-10. 13С-ЯМР-Спектры аспарагиновой кислоты и ß-mpem-бутплового эфира бензилоксикарбониласпарагиновой кислоты.- 65 м. д., для /3-углеродного атома между - 1 7 и - 70 м. д . и для у- и5-углеродных атомов между - 1 7 и - 50 м. д . Сигналы атомов углерода аро^матических и гетероароматических колец находятся между — 110 и —140 м.д.На рис. 1-10 приведены 13С-ЯМР-спектры аспарагиновой кислоты и ß-mpemбутилового эфира бензилоксикарбонил-ь-аспарагиновоя кислоты.В полипептидах и белках индивидуальные сигналы сдвигаются и перекрываются из-за взаимодействия отдельных аминокислотных остатков. Этозатрудняет количественное отнесение сигналов к определенным группам.Например, при применении в качестве внутреннего стандарта ДСС сигналыпротонов у метальных групп алифатических остатков лежат между 0,9 и1.5 м. д., у остальных протонов алифатических боковых цепей между 1,5 и3,5 м.д., у протонов а-С-атома между 3,5 и 4,5 м.д., у ароматически-38Получение аминокислотсвязанных СН-протонов, а также у протона пептидной группы CO-NHмежду 6,7 и 9,0 м.д.
Резонансная область С2-протона имидазола гистидиналежит между 8,0 и 9,2 м.д., а NH-индольного протона триптофана между9,0 и 11,0 м.д.1.5.Получение аминокислот [1—5, 48—53]Аминокислоты можно получать путем выделения из белковых гидролизатов, с использованием микробиологических методов, с помощью ферментативных методов или путем химического синтеза.
Первые три подходадают ь-аминокислоты, а при химическом синтезе получаются DL-соединения, которые нужно еще разделить на оптические антиподы. До недавнеговремени аминокислоты удавалось получить только в очень малых количествах, но в последние годы их производство приняло индустриальныемасштабы и в 1977 г. достигло 400 000 т.
Аминокислоты используются каквкусовые добавки в пищевой промышленности (глутамат натрия, аспарагиновая кислота, цистин, глицин и аланин), как питательные растворы и терапевтические средства в медицине (все протеиногенные аминокислоты),как добавки для улучшения неполноценных питательных белков и фуража(лизин, метионин, триптофан), как промежуточные вещества в косметической промышленности (серии, треонин, цистеин), а также как исходные вещества для синтеза различных пептидов.1.5.1.Выделение из белковых гидролизатовПри получении аминокислот белки прежде всего расщепляют с помощьюосновного, кислотного или ферментативного гидролиза [54]. В классическом методе кислотного гидролиза [55,56] используют 6 н. НО (1К11ППО °С) или 8 н.
H 2 SO 4 . Время реакции от 12 до 72 ч в зависимости отстроения белка. Очень устойчивы к гидролизу пептидные связи, образованные лейцином, изолейцином и вал ином. При этом триптофан разрушаетсяполностью, серии и треонин до 10%,Потери аминокислот, обусловленные присутствием углеводов, могутбыть снижены, если работу проводят в вакууме и применяют большой избыток кислоты (белок: НС1 = 1:10000).В других методах кислотного гидролиза используют смесь пропионовойкислоты с 12 н.
НС1 [57] (время реакции при 160 "С 15 мин, при 130 °С 2 ч),3 н. 4-толуолсульфокислоту [58] или 3 н. меркаптоэтансульфоновую кислоТУ [59] (время реакции при 110 °С 24 ч). Последний метод используетсяспециально для аналитических целей. Триптофан при этом сохраняется на95%.При щелочном гидролизе с 6 н. раствором гидроксида бария в автоклаве (давление ~ 700 кПа) разрушаются гидроксиаминокислоты и цистеин, вто время как триптофан сохраняется.Аминокислоты39Очень легко протекает ферментативный гидролиз белков.
Для осуществления полного гидролиза необходимо применение комбинации несколькихферментов, что связано с высокой специфичностью протеаз. На практикеприменяют протеиназы животного и бактериального происхождения (эндопептидазы), такие, как трипсин, пепсин и папайи в комбинации со специфическими амино- и карбоксипептидазами [60]. Нередко хорошие результатыполучают, используя неочищенный фермент (сырой препарат), напримерпанкреатин, который содержит все пищеварительные ферменты поджелудочной железы (его используют при получении аспарагина и глутамина).Выделение отдельных аминокислот из белкового гидролизата не сопровождается никакими затруднениями в тех случаях, когда они содержатся вдостаточно высоких концентрациях и заметно отличаются друг от другапо свойствам.Глутаминовая кислота, например, кристаллизуется прямо из концентрированного гидролизата, насыщенного хлористым водородом, цистин и тирозин отделяют благодаря их плохой растворимости в воде.
Селективноеотделение ароматических аминокислот удается выполнить с помощью адсорбции на активированном угле. Полученную при гидролизе смесь аминокислот лучше всего разделить хроматографически. Выделению отдельныхкомпонентов предшествует обычно разделение на кислые, основные и нейтральные группы аминокислот, при этом большое значение имеют электрофорез и специфические ионообменники. Раннее распространенные методыразделения, такие, как фракционная перегонка эфиров (по Фишеру), экстракция моноаминокарбоновых кислот н-бутиловым или амиловым спиртом(по Дакину), осаждение «гексоновых оснований» лизина, аргинина и гистидина фосфорновольфрамовой кислотой или флавиановой кислотой, теперьимеют только второстепенное значение.1.5.2.Микробиологические методы [53, 61]Почти все протеиногенные аминокислоты можно получать с помощьюспецифических микроорганизмов. Принцип микробиологического метода(ферментации) заключается в аэробном выращивании микроорганизмов вразбавленных питательных растворах, содержащих усвояемые источникиуглерода и азота, как, например, углеводы, углеводороды, органические инеорганические соединения азота, минеральные соли и ростовые вещества.Можно использовать также полупродукты биосинтеза аминокислот.
Например, глутаминовая кислота получается из а-кетоглутаровой кислоты,изолейцин и серии можно получать ферментацией культуры, содержащейтреонин или глицин. В качестве микроорганизмов применяются культурыдикого типа, например Cornynebacterium glutamicum и Brevibacteriumflavum, а также мутанты, которые производят большое количество специфических аминокислот.В случае ауксотрофных мутантов микроорганизмы не располагают некоторыми ферментами, необходимыми для биосинтеза определенных ами-40Получение аминокислотнокислот.
Синтез поэтому может остановиться на одной из первых ступеней или пойти по другому пути. Если продуктом первой ступени или продуктом такого побочного пути являются аминокислоты, то они производятся и аккумулируются в большом количестве, например применение мутанта, дефицитного по гомосерину из Eschrichia coli, обусловливает накопление лизина. Отсутствие гомосериндегидрогеназы блокирует гомосеринтреонин-метиониновый путь синтезасноСН,H-C-NH,СООНполуальдегидаспарагиновойкислотысн^онгомосериндегидрогеназа***СКЦH-C-NH,СООНгомосвринIL-лизинв пользу побочного синтеза, приводящего к образованию лизина.
В случаерегуляторных мутантов, применяемых для получения аргинина, метионина, изолейцина и триптофана, «наработка» аминокислот осуществляетсяпутем нарушения механизма обратной связи.Таблица 1-7. Аминокислоты, полученные ферментациейМикроорганизмыИсточники С, NCorynebacteriumglutamicumГлюкоза или гидролизаткрахмала, патока тростниковогои свекловичного сахара, аммиак,мочевинаПатока тростникового исвекловичного сахара, гидролизаткрахмала, м-алканы, уксуснаякислотаЭтанол, неорганические соединения азотаФумаровая кислота, аммиакФенилмолочная кислотаНефть, нитрат аммонияФосфаты, сульфат магния,хлорид марганца(11)Хлорид кальция и сульфатжелеза(11) в следовых количествахМутанты Brevibacterium flavumМутанты Preudomonas Irifoli и Е.
coliSerratia marcescensРод CorynebacteriumРод BrevibacteriumCandida lipopytica,E. coli и др.ПолученныеаминокислотыGluLys, Val, Orn,Met, Trp, GluLys, Arg, HeAspPheGlu, Ala, AspLys, Arg, ТугGly, Trp, Pro,SerАминокислоты41Особое техническое значение приобрела ферментация глутаминовой кислоты так называемыми микроорганизмами дикого типа. Культивируютбактерии в стерилизованных ферментерах при 35° С, используя в качествеисточника углерода глюкозу или патоку и вводя в систему воздух и аммиак. Через 40 ч из культуры можно изолировать глутаминовую кислоту.Выход составляет 50 кг аминокислоты на 100 кг введенной глюкозы. Глутаминовая кислота в форме моноглутамата натрия применяется в значительных количествах как вкусовое вещество и приправа в пищевой промышленности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
