Х.-Д. Якубке, Х. Ешкайт - Аминокислоты, пептиды, белки (1128686), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Для хроматографирования в первом направ-58Анализ аминокислотТаблица 1-10. Значения R, и RLtaАминокислотаCysLysHisArgAspSerGlyGluThr*/*Leu0,070,140,200,200,190,270,260,300,350,040,090,110,140,210,230,270,320,35протеиногенных аминокислот [138]Аминокислота«fÄAlaProТугTrpMetValPhe0,440,430,450,500,550,600,680,720,730,440,500,560,630,750,770,910,981,00HeLeuLe„лении применяют главным образом систему бутанол — уксусная кислота — вода (4:1:5); во втором направлении работают с несколькими системами: этанол — вода (95:5), бензиловый спирт — вода (70:30), пиридин —амиловый спирт — вода (35:35:30).1.7.1.2.Тонкослойная хроматография[139 — 143]Методом тонкослойной хроматографии (ТХ) можно быстро разделитьаминокислоты; метод требует несложного оборудования и малых исходных количеств.
Для изготовления слоев толщиной 0,1 — 0,3 мм применяют стандартные носители, такие, как силикагель, оксид алюминия, порошок целлюлозы, ионообменники на основе целлюлозы, полиамиды, а также полиакриламидный и декстрановый гели. В зависимости от материаланосителя ТХ бывает адсорбционной (например, разделение на силикагеле иоксиде алюминия) или распределительной (например, разделение на слояхцеллюлозы).
В качестве подвижной фазы применяют те же системы, что идля бумажной хроматографии.На рис. 1-13 приведены результаты двумерного разделения гидролизатаB-цепи инсулина на силикагеле G.При определении очень малых количеств аминокислот применяют проявлениеТХ-шгастинки флуорескамином [раствор 10 мг флуорескамина в смеси ацетон/гексан(1:4)] [145]. После элюирования подходящим растворителем наблюдают флуоресценцию при 366 нм. Предел обнаружения метода при проявлении с помощью производного флуорескамина 10 пмоль.Особенно легко и быстро удается разделить смесь аминокислот с помощью комбинации двумерного разделения, например тонкослойного электрофореза на целлюлозе и хроматографии (метод «отпечатков пальцев»).
Сначала проводят электрофорез (низковольтный электрофорез без охлаждения, 20 В/см, муравьиная кислота), азатем хроматографируют во втором направлении, например с элюентом составаярет-бутанол: метанол: пиридин: муравьиная кислота:вода (33:43:9,6:0,4:20). В слу-Аминокислоты59QPb.0"иThr.,it•OTyrлvwQPro0 0*^LysРис. 1-13. Разделение гидролизата B-цепи инсулина с помощью тонкослойной хроматографии [144]. Состав элюента и время: направлениеI — хлороформ/метанол/17%-ный раствор 1ЧН4ОН (2:1:1), 75 мин; направление II — фенол/вода (75:25), 180 мин.чае тонкослойного электрофореза биологического материала не требуется предварительной деминерализации (обессоливания) образца.
Легкоподвижные чужеродныеионы через небольшой промежуток времени после начала электрофореза уходят изобласти разделения аминокислот.1.7.1.3.Ионообменная хроматография [146, 147]После установления условий проведения количественной нингидринной реакции Муру и Штейну удалось в 1948 г. разделить 2,5 мг гидролизата сывороточного альбумина быка с помощью распределительной хроматографиина колонке с крахмалом. Элюат был разделен на 400 фракций, в каждойфракции проведена нингидринная реакция, и из интегральных кривых поглощения, соответствующих отдельным аминокислотам, рассчитывалисьих молярные доли в смеси.
На коллег-современников большое впечатлениепроизвели высокая скорость анализа (1 нед), малое количество анализируемого вещества и малая погрешность ( ± 3 % ) .С переходом к ионообменной хроматографии Шпакман, Мур и Штейнсмогли автоматизировать анализ [148]. Принцип работы первых автоматических аминокислотных анализаторов показан на рис. 1-14.В качестве ионообменников применялись смолы дауэкс и амберлит. Разделениеаминокислот проходило в колонке 9,9 х 150 см с помощью непрерывно прокачивав-Анализ аминокислот60<1()()—Рис.
1-14. Автоматический аминокислотный анализатор по Шпакману,Муру и Штейну.мого нитратного буфера (pH 3,25 и 4,25). Элюат подавался в капиллярную тефлоновую трубку /, где взаимодействовал с нингидрином (15 мин при 100° С); интенсивность нингидринного окрашивания измерялась в проточном колориметре 2 и регистрировалась самописцем 3.
Время анализа 24 ч. Мур и Штейн совместно с Анфинсеном получили за эту работу в 1972 г. Нобелевскую премию по химии.Автоматические аминокислотные анализаторы все время совершенствуются [149]. Современные чувствительные автоматические анализаторы требуют для разделения белкового гидролизата 2 — 3 ч.
Цех и Вольтер предложили жидкостную хроматографическую систему под давлением; это позволяет проводить анализ за 45 мин, причем предел обнаружения лежит вобласти пикомолей.1640302010Время, минРис. 1-15. Жидкостная хроматограмма высокого давления гидролизатов аминокислот. Разделение на колонке Хевлетта — Паккарда HP1010 В (3 х 250 мм), наполненной сильнокислой полистироддивинилбензольной ионообменной смолой (размер зерен 8 — 2 мкм): концентрация аминокислоты: 500 пмоль/л, реагент для детектирования —флуорескамин; детектор флуориметрический типа Хевлетта — Паккарда (тип 1033 А).1 — Asp, 2 — Thr, 3 — Ser, 4 — Glu, 5 — Gly, 6 — Мл, 7— Cys,8 — Val, 9 — Met, 10 — lie, // — Leu, 12 — Туг, 13 — Phe, 14 — Lys,15 — His, 16 — Arg.Аминокислоты1.7.1.4.61Газовая хроматография [151 — 156]Газовая хроматография предложена как метод Джеймсом и Мартином в1952 г.; как метод химического анализа ГХ отличается особо высокой производительностью.
Благодаря высокой скорости потока подвижной фазы(газообразные водород, гелий, азот и аргон) достигается быстрое установление фазового равновесия. В качестве стационарной фазы применяют чаше всего силикон, полиэфир или полигликоль на таких носителях, как цеолит, хромосорб, стерхамол и др. Длина колонки при обычных разделенияхколеблется от 1 до 6 м, при разделениях энантиомеров на капиллярных колонках их длина достигает ISO м. Идентификация разделенных веществпроизводитсявысокочувствительнымидетекторами—пламенно10ионизационным (10~ моль), электронзахватывающим, а также работаю16щими на основе измерения теплопроводности (10~ моль). Предел обнару-Таблица 1-11. Производные аминокислот для газохроматографического разделенияАминофункцияАцетилТрифторацетил(ТФА)Гептафторбутирил(ГФБ)Триметилсилил(TMQДинитрофенил(ДНФ)Циклические производные аминокислотФенилтиогидантоин(ФТГ-аминоки слоты)Метилтиогидантоин(МТГ-аминокислоты)Оксазолидинон[2,2-бие(хлордифторметил)оксаэолидин5-он]КарбоксильнаяфункцияНеподвижнаяфазаЛитератураПропиловыйэфирМетиловыйэфирБутиловый эфирМетиловыйэфирПропиловыйэфирИзоамиловыйэфирТриметилсилиловый эфир (ТМСэфир)МетиловыйэфирКарбовакс 20-МХ159XE-60/QE-1/MS-200160Апизон МПЭГ/адипат/апиезон161162OV-1163SE-30164OV-11165SE-30166OV-101/OV-225167ТМС-эфирыТМС-производные OV-17Силикон16816962Анализ аминокислоти8121620242832364044Время, минРис.
1-16. Гх-анализ N-ГФБ-пропиловых эфиров 20 протеиногенныхаминокислот.жения лежит в нано- и пикомольной области. Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией предоставляет идеальные возможности дляобнаружения неизвестных аминокислот и пептидных структур [157 — 158].Существенный недостаток ГХ состоит в том, что для анализа нельзя непосредственно использовать труднолетучие аминокислоты.
Сначала их нужно перевести в летучие соединения путем получения подходящих производных или с помощью реакций разложения. Наилучшим оказалось одновременное замещение амино- и карбоксильной функций аминокислот. В табл.-1-11 приведены производные аминокислот, скоторыми удалось полное разделение, или получены достаточно удовлетворительные результаты. Продукты распада, такие, как альдегиды, амины, аминрспирты,нитрилы, гидроксикислоты и др., до сих пор не удалось однозначно идентифицировать.О применении газовой хроматографии для определения рацемизациипри пептидном синтезе сообщается в разд. 2.2.6.2, для установления аминокислотной последовательности — в разд. 3.6.1.2.2.На рис. 1-16 приведены результаты газохроматографического разделения 20 протеиногенных аминокислот в виде N-гептафторбутирилпропиловых эфиров. Получение производных осуществлялось взаимодействием сангидридом гептафтормасляной кислоты.1.7.1.5.Хроматографическое разделение энантиомеровХроматографические методы разделения энантиомеров применяются прежде всего при определении конфигурации аминокислот, для исследованиярацемизации и для препаративного выделения небольших количеств энантиомеров.
Некоторые аминокислоты могут быть разделены на оптическиеАминокислоты63антиподы с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии. Приэтом разделение достигается применением оптически активных элюэнтовили взаимодействием с хиральными молекулами целлюлозы.На алыинатсиликагелевых бумагах ь-аминокислоты более подвижны,чем D-аминокислоты.В случае лигандообменной хроматографии [170 —173] применяют хиральные полимерные носители, которые содержат ионы переходных металлов (Cu 2 + , Ni 2 + и др.), координационно связанные оптически активными аминокислотами так, что остаются ненасыщенные координационныесвязи.
В ходе разделения свободные координационные связи занимаютсялигандами подвижной фазы. Таким образом был разделен ряд DLаминокислот на полистирольных смолах с ь-пролином, сульфированнымфенилаланином [174], ь-гидроксипролином [175] и другими энантиомерамиаминокислот в качестве фиксированных лигандов. Некоординированныеэнантиомеры элюировались в виде комплекса с ионом Си 2 + , координированные энантиомеры вымывались концентрированным аммиаком.В случае газохроматографического разделения энантиомеров различаютметоды, основанные на двух принципах:во4530Время, минРис. 1-17. Разделение энантиомеров изопропиловых эфиров пентафторпропиониламинокислот в стеклянной капиллярной колонке (20 м) сN-TOA-L-Phe-L-Asp-OHcimioioreKCMOBbiM эфиром в качестве неподвижной фазы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
