Х.-Д. Якубке, Х. Ешкайт - Аминокислоты, пептиды, белки (1128686), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Этот метод успешно применяется для расщепления глутаминовой кислоты, гистидина,треонина, аспарагиновой кислоты, аспарагина и глутамина.Методы кристаллизации успешно применяются также в случае аммониевых солей ацилированных аминокислот (Trp, Phe) или в случае солей аминокислот с ароматическими сульфокислотами, например сульфаниловаякислота или антрахинон-/3-сульфокислота используются для разделения лизина, сульфаниловая кислота — для серина.1.6.2.Химические методыХимические методы расщепления рацематов основаны на образовании диастереоизомерных солей с оптически активными вспомогательными веществами и разделении их фракционной кристаллизацией.
Для образования солей с 1Ч-ацил(или Ы-алкил)-аминокислотами применяют алкалоиды, а-фенилэтиламин, фенхиламин, хлорамфеникол и его синтетический предшественник L(+)-/ирго-1-(4-нитрофенил)2-амино-1,3-пропандиол.Для образования солей с такими производными аминокислот, как эфиры, амиды, гидразиды и нитрилы, в качестве оптически активных вспомогательных веществ успешно применяют винную кислоту, дибензоил-Dвинную кислоту или D-камфорсульфокислоту.Успех химического расщепления рацематов зависит от вида и количества применяемого растворителя, температуры кристаллизации и легкостиотщепления вспомогательного вещества от диастереомерной соли. Тольков исключительных случаях выделение оптически чистого энантиомера удается без последующей перекристаллизации. Высокую чистоту имеют соединения, самопроизвольно выделившиеся в твердую фазу в виде кристалловиз растворов продуктов реакции. Можно повлиять на поведение энантиомера при кристаллизации, добавляя вспомогательные вещества противоположной конфигурации.
Так, например, при добавлении L-ВИННОЙ кислотывместо D-винной диастереомер, который раньше оставался в маточном растворе, выделялся в виде кристаллов высокой степени оптической чистоты.1.6.3.Ферментативные методыСреди ферментативных методов получения оптически активных аминокислот различают три направления:1) селективное окисление или декарбоксилирование энантиомеров DLаминокислот специфическими ферментами;2) катализируемый ферментами асимметрический синтез производныхаминокислот;54Разделение рацематов аминокислот3) ферментативный гидролиз а-амино- или а-карбоксизамещенных производных аминокислот.Первое направление нашло лишь ограниченное применение для получения специфически меченных энантиомеров.
Из экономических соображенийвместо изолированных оксидаз и карбоксилаз вводят микроорганизмы(дрожжи, PeniciUium glaucum, Aspergillus niger. E. coli и т. д.), которые содержат нужные системы ферментов и могут использовать в своем обменетолько один антипод (обычно ь-форму).Второе направление использует стереоспецифическое образование анилидов и фёнилгидразидов N-ациламинокислот из Ы-ацил-ш.-аминокислот ианилина или фенил гидразина, катализируемое папаином и пепсином.
Дляуспешного протекания реакции должны получаться нерастворимые продукты (из хорошо растворимых исходных веществ). Метод применим и длярасщепления аминокислот с двумя центрами хиральности. Это было показано Соколовской и др. [108] на примере реакции бисбензилоксикарбонилдиаминопимелиновой кислоты с анилином, катализируемой папаином. Приэтом получается кристаллический ix-моноанилид (исходное DD-ооединениеостается неизменным).Большое значение имеет введенный Гринштейном ферментативный гидролиз, прикотором ацетил- или хлорацетиламинокислоты расщепляются ацилазами. Реже применяют расщепление эфиров DL-аминокислот с помощью эстераз.
Благодаряиспользованию фиксированных на носителе микробных ферментов (в ос-Рис. 1-12. Непрерывное производство кристаллических L-аминокислотна иммобилизованной аминоацилазе. DL — ацетил-ОЬ-аминокислота,L — L-аминокислота, D — ацетил-о-аминокислота, / — 3 — приборыдля измерения скорости потока, pH и температуры, 4 — камера с горячей водой, 5 — колонка с иммобилизованной аминоадилазой,6 — автоматический самописец, 7 — испаритель, 8 — камера кристаллизации, 9 — фильтр-разделитель, 10 — камера для рацемизации.Аминокислоты55новном это системы аминоацилаза — ДЭАЭ-сефадекс) этот процесс былавтоматизирован и заметно удешевлен. Метод применяется для промышленного получения ряда L-аминокислот (Phe, Val, Met, Тгр, ДОФА и др.). Остающиеся при расщеплении N-ацил-о-аминокислоты рацемизуются и снова вводятся в процесс расщепления [S3].
Схема непрерывного процесса получения L-аминокислот с помощью иммобилизованных ацилаз представлена на рис. 1-12.1.7.Анализ аминокислот [109, ПО]Для аналитического определения аминокислот разработано множество методов, из которых здесь рассматриваются только методы бумажной, тонкослойной, ионообменной и газовой хроматографии, а также ферментативные и изотопные методы.Аминокислотный анализ существенно способствовал бурному развитиюхимии белка.
Главными областями применения аминокислотного анализа(наряду с идентификацией отдельных аминокислот) являются установлениеаминокислотного состава белковых гидролизатов, определение первичнойструктуры белков, а также аналитический контроль пептидного синтеза.1.7.1.Хроматографические методы [109—117]При хроматографическом разделении смесь веществ в подвижной фазетранспортируется через стационарно закрепленную (неподвижную) фазу.При этом компоненты смеси из-за различий в строении, растворимости,полярности или заряде вступают в специфическое взаимодействие с неподвижной фазой, которое обусловливает различные скорости транспортакомпонентов.В соответствии с агрегатным состоянием подвижной фазы различаютжидкостную хроматографию (ЖХ) и газовую хроматографию (ГХ).
Крометого, по совокупности возможных комбинаций разделения различают следующие виды хроматографии: жидкость — твердая фаза (ЖТХ),жидкость —Жидкость (ЖЖХ), газ — твердое тело (ГТХ) и газожидкостную (ГЖХ).Если растворенное вещество вступает во взаимодействие с твердой стационарной фазой, то основной эффект разделения определяется адсорбционным равновесием. В этом случае говорят об адсорбционной хроматографии в противоположность распределительной хроматографии, при которойразделение компонентов происходит соответственно их распределению по(акону Нернста. В случае жидкостной хроматографии на процесс разделения могут оказывать влияние физико-химические свойства подвижной фазы. Если состав подвижной фазы в ходе процесса разделения ступенчатоили непрерывно меняется, то говорят о градиентной хромотографии.Современная высокоэффективная хроматография основана на ис-Анализ аминокислот56пользовании стационарных фаз с частицами малых диаметров с применением давления до 700 бар.
В газовой хроматографии высокий эффект разделения достигается применением капиллярной техники, в особенности введением стеклянных капилляров. Современные аминокислотные анализаторы автоматизированы таким образом, что процесс анализа занимает немного времени. Градиентное элюирование осуществляется дозирующимиустройствами. Высокочувствительная детекторная система делает возможной точную работу с нано- и пикограммовыми количествами.Идентификация аминокислот производится в большинстве случаев с помощью окрашенных или флуоресцирующих производных или с помощьюрадиоактивных реагентов [118]. Особенно важными являются реакции снингидрином и флуорескамином.В случае реакции с нингидрином получается сине-фиолетовая окраска (максимумпоглощения 570 нм; для пролина 440 нм) в результате взаимодействия ааминогруппы и реагента по схеме:ПО«— QНNH2нингидрин~*Техника работы с флуорескамином разработана в 1972 г.
[119 — 122]. Аминокислоты реагируют при комнатной температуре с 4-фенилспирофуран-2(ЗН)-1'фталаном (флуорескамин) и дают сильнофлуоресцирующие соединения. Сам флуорескамин и полученные разрушением его избытка продукты гидролиза не обнаруживают собственной флуоресценции. В противоположность нингидрину реагент практически нечувствителен к аммиаку.
Примерно так же ведет себя 2-метокси-2,4дифенил-3-(2Н)-фуранон (МДФФ).флуорескаминАминокислоты37Из других показательных реакций высокую чувствительность имеют реакции с2,4,6-тринитробенэолсульфокислотой, 1,2-нафтохинон-4-сульфокислотой (аминокислотный реагент Фолина), 4,4'-тетраметилдиаминодифвнилметаном (ТДМ, голубоеокрашивание) 1123], а также образование интенсивно флуоресцирующих производных с 2-фталевым альдегидом в присутствии восстановителей [124 — 126], пиридоксалем и Zn(II) [127, 128], дансилхлоридом (5-диметиламинонафталинсульфонилхлоридом) [129, 130] и [3Н]-бансилхлоридом (5-ди-н-бутиламинонафталинсульфонилхлоридом) [131, 132] и мансилхлоридом (Ы-метил-2-анилин-6-нафталинсульфонилхлоридом) [132]. Интенсивность флуоресценции можно значительно усилить применением смешанных систем растворителей, например ДМСО—Н2О[133].1.7.1.1.Бумажная хроматографияБумажная хроматография, впервые примененная в 1944 г.
Консденом, Гордоном и Мартином, представляет собой распределительную хроматографию, при которой адсорбционно связанная с целлюлозой вода образуетстационарную, а смесь органических растворителей — подвижную фазу.Непрерывная диффузия растворенных компонентов из одной фазы в другую приводит к их распределению между фазами. Отношение концентраций при таком распределении соответствует закону распределения НернстаС = с2/с1, где С — зависящий от температуры коэффициент распределения, а С[ и с 2 — концентрации вещества в обеих фазах.
После идентификации разделенных веществ их положение на хроматограмме характеризуетсякоэффициентом удерживания Rf (от англ. retention factor):Rрасстояние, пройденное веществом=_.расстояние, пройденное подвижной фазойЧасто коэффициент удерживания указывают в процентах (hRj) или как относительную величину (к стандарту) Rst (расстояния, пройденные отдельными веществами, относят к одному определенному веществу, см. Ä Leu в табл.
1-10).Существует определенная связь между строением и значением Rj. Аминокислоты с заряженными или полярными боковыми цепями (аминодикарбоновые и диаминокарбоновые кислоты, гидроксикислоты) имеют болеенизкие значения Rj, чем аналогичные аминокислоты с незамещенными боковыми цепями. С повышением гидрофобного влияния боковой цепи повышается значение Rj-, например, в ряду Gly < Ala < Val < Leu.В табл. 1-10 приведены значения Rf и Ä L e u протеиногенных аминокислот, полученные при хроматографии на бумаге шляйхер-шюль 2043 b в системах бутанол — уксусная кислота — вода (4:1:1) и бутанол — изомасляная кислота — уксусная кислота — вода (5:0,5:0,7:5). Значения RLeu — результаты трехкратного элюирования. Значения коэффициентов удерживания воспроизводятся, если хроматографирование идет в направлении волокна бумаги.В настоящее время бумажная хроматография применяется чаще всегокак двумерная хроматография.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
