Х.-Д. Якубке, Х. Ешкайт - Аминокислоты, пептиды, белки (1128686), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Температура 130° С; температурная программа: 10° С/миндо 165° С.64Анализ аминокислот1) получение производных энантиомеров с оптически активными реагентами с последующим разделением на оптически неактивной фазе;2) непосредственное разделение энантиомеров на хиральной неподвижной фазе [176, 177].В качестве хиральных реагентов для получения пригодных для хроматографии диастереомерных производных аминокислот используют оптическиактивные амиловый спирт как компонент этерификации для N-пентафторпропиониламинокислот [178] и а-хлоризовалерилхлорид как ацилирующийкомпонент для эфиров аминокислот [179].
Применение продажных стеклянных капилляров с готовой неподвижной фазой обеспечивает оптимальноеразделение большинства аминокислот.Использование второго принципа позволило разделить зфиры N-трифторацетиламинокислот в стеклянных капиллярах (диаметр* IS мм, длина150 м), которые содержат в качестве оптически активной неподвижной фазы эфир 1М-трифторацетил-ь, ь-дипептида. Циклогексиловый эфир N-ТФА-Val-Val [180] был применен для энантиомерного разделения аминокислот, ациклогексиловые эфиры Ы-ТФА-Phe-Leu [181] и Ы-ТФА-ь-АЬи-ьАЬи [182]~использовались при анализе образцов метеоритов. Особой термическойустойчивостью отличаются бисциклогексиловый эфир N-TOA-Phe-Asp [183]и карборанилпропиловый эфир N-T<t>A-Val-Val [184]. По Кбнигу, эффектразделения основан на пространственном сближении между партнерамиодинаковой конфигурации, причем кроме связывания водородными мостиками важную роль играет также диполь-дипольное взаимодействие междудипептидными и аминокислотными производными.Байер и др.
[185, 186] предложили хиральный полисилоксан для газохроматографического разделения энантиомерных аминокислот и другихDL-соединений (гидроксикислоты, спирты, амины). В качестве хиральныхякорных групп используются аминокислоты или пептиды, которые присоединяются к термически устойчивому органосилоксановому остову. Особенно подходящей оказалась фаза Chirasil-Val с mpem-бутиламидом ь-валина вкачестве оптически активного лиганда.1.7.2.Масс-спектрометрический анализаминокислот [187 — 189]Принцип масс-спектрометрического анализа заключается в регистрациифрагментных ионов и радикалов, которые образуются при разложениипервичного, полученного электронным ударом, богатого энергией молекулярного иона.
Для оценки спектра требуется знание механизма реакцийразложения ионизованной аминокислотной молекулы.Характерное для а-аминокислот разложение на стабилизированные мезомерией иминиевые ионы и относительно устойчивый радикал СООН ирадикал боковой цепи R- идет по следующей схеме:65АминокислотыH,N-CH-IHjN-C-COOHRШн^-8н-соон] • *'ПМЧ - М-7Д1Кроме указанных реакций, дальнейшее фрагментирование зависит отстроения боковой цепи.
В показанном на рис. 1-18 масс-спектре треонина,например, кроме пика нормальных фрагментов (МЧ = 74 и МЧ — 45)можно наблюдать еще два пика относительно высокой интенсивности. Ониобусловлены протекающей реакцией:.ОН«-СНHaN-CH-C-0<В связи с трудной летучестью аминокислот проба вносится в ионный источник масс-спектрометра при 10~ 4 — 10~ 5 Па и 100 — 150 "С. Благоприятновведение летучих производных аминокислот, которые применяются и длягазовой хроматографии.Масс-спектроскопия приобрела особое значение при анализе аминокислотных последовательностей белков (разд. 3.6.1.2.2).
Для определения фенилтиогидантоина используют масс-спектпроскопию полевой десорбции ионов, причем применяется прибор высокого разрешения с фотодетектором.FS7wo%Е75тГ 26H/I-CH-COOH&4-ОНСН,soМ-СН,КМM-HjO30507025.67%90М+11Ю130«0Рис. 1-18. Масс-спектр треонина (70 эВ).170W0 21066Анализ аминокислотМожно легко определять отдельные аминокислоты, так как благодаря высокой интенсивности молекулярных пиков из-за малого фрагментированияи относительно слабого межмолекулярного взаимодействия получаютспектры высокого разрешения.1.7.3.Методы анализа с использованиемизотопов [192 — 194]Изотопные методы являются обычными методами аминокислотного анализа; к ним относятся:1) метод изотопного разбавления и2) метод активированных производных.В случае метода изотопного разбавления смешивают анализируемуюпробу с определенным количеством меченой аминокислоты и рассчитывают степень разбавления изотопа после выделения определяемой аминокислоты:•СИгде В — искомое количество аминокислоты в пробе, А — количество добавленной меченой аминокислоты, С о — концентрация изотопного элемента в добавленной аминокислоте и С — концентрация изотопного элементав выделенной аминокислоте.
Об ультрачувствительном методе изотопногоразбавления для определения L-аминокислот сообщают Рубин и Гольдштейн [195].В случае часто применяемого метода активированных производныхаминокислота, подлежащая определению, сначала метится взаимодействием [195] с реагентами, которые содержат устойчивые или радиоактивныеизотопы. Затем ее смешивают с избытком немеченого производного аминокислоты и очищают до постоянной молярной концентрации изотопа Сс.Количество w искомой аминокислоты находят по формулегде W — количество добавленного неактивного производного, Сг — молярная концентрация изотопа в производном, полученном из реакции междуочищенной аминокислотой и реагентом.Особо чувствительный метод двойной метки основан на применении меченого [3Н]-дансилхлорида в качестве реагента и меченой [14С]аминокислоты как внутреннего стандарта.
Отношение 3 Н: 1 4 С в дансильномпроизводном зависит от отношения количества добавленной [14С]аминокислоты к концентрации немеченой аминокислоты в пробе. Этот метод особенно подходит для идентификации аминокислот в биологическомматериале. Его чувствительность лежит в пикомольной области [196].Аминокислоты1.7.4.67Ферментативные методыФерментативные методы аминокислотного анализа основаны на определении продуктов реакции, которые образуются при биохимическом расщеплении аминокислот. Из-за их сравнительно низкой чувствительности(10~2 — 10" 4 моль/л) эти методы применяют только при серийных анализах определенных аминокислот.
К анализируемой смеси аминокислот добавляют специфическую декарбоксилазу (или же производящие эту декарбоксилазу микроорганизмы), и получающуюся при декарбоксилированииуглекислоту определяют манометрически в аппарате Варбурга.Все большее значение приобретает определение аминокислот с помощью ферментативных электродов [197 — 200], в которых стереоселективное расщепление катализируется иммобилизованными ферментами; например, в случае оксидазного электрода, специфичного к L-аминокислотам,расщепление протекает по схемеL-аминокислота + О 2L-аминокислотная оксидаза• » кетокислота + Н 2 О 2 + NH 3Для определения можно использовать образующиеся Н 2 О 2 или NH 3 .
Аммиакможно определять титрованием, пероксид водорода — либо амперометрически, либо по вторичной реакции с ионами 1~. Изменение концентрации 1~ можно регистрировать иодселективным электродом.1.8.Специфические реакции аминокислотХимические реакции аминокислот определяются их функциональнымигруппами и столь многочисленны, что следует остановиться только наважнейших из них.
О реакциях, которые ведут к производным аминокислот, имеющим значение для синтеза пептидов, говорится в гл. 2.1.8.1.Образование комплексов с металлами [201]Аминокислоты образуют с ионами тяжелых металлов хелатные комплексы, из которых наиболее известны темно-синие, хорошо кристаллизующиеся соединения с Си(Н). Образование хелата типа СиА2 используется прикомплексометрическом титровании ряда аминокислот. Титрование производят раствором сульфата меди (II) при pH 9 в присутствии мурексида какиндикатора [202].Анализ кристаллических структур комплексов белков с металлами показал, что аминокислотные комплексы металлов имеют октаэдрическое строение, причем два остатка аминокислоты связаны с центральным атомомметалла амино- и карбоксильными группами, а свободные координационные места заняты водой.
Особой устойчивостью отличаются комплексы саминокислотами, имеющими функциональные боковые цепи, как, например, гистидин, азот имидазола в котором образует дополнительную связьс центральным атомом.68Специфические реакции аминокислотЯ!?0Н а NH a -CH a\/^ОО—СиО/ \С - О ' O^#гидрат бис-глицината меди (II)CuJOyU.KJOHN-CHVОНд NH—СНI у/.0Си(/ \CH-NH 0 H aО^\'H0дигидрат бис-иЬ-пропинатамеди(И)Си(Рго)а.2НаОс^*гидрат бис-Ь-гистидината никеля(И)N i ( H i s ) 2 . H20Бек и др. [203] провели систематические исследования комплексов аминокислот и простых пептидов с платиной (II). При этом оказалось, что построенные из аминокислотных комплексов платины (II) олигопептидныекомплексы типа c&-PtAS2X2 (AS 2 — эфир дипептида, X — анионный лиганд, например С\~) обладают противоопухолевым действием.1.8.2.Реакции с азотистой кислотойСвободные аминокислоты как первичные амины реагируют с HNO 2 с отщеплением азота. При этом аминогруппа замещается гидроксилом и изменения конфигурации у хирального атома углерода не происходит.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
