Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 30
Текст из файла (страница 30)
фермент-ингибиторный комплекс. Когда в реакционной смеси одновременно присутствуют и субстрат, н ингибитор указанного типа, они конкурируют за один и тот же связывающий центр на поверхности фермента. Один из наиболее подробно изученных примеров конкурентного ингибирования — это ингибирование сукцинатдегидрогеназы малонатом (1), конкурирующим за один и тот же центр с субстратом сукцинатом (Я).
Сукцинатдегидрогеназа катализирует образование фумарата в результате отщепления атома водорода от каждого из двух а-углеродных атомов сукцината (рис. 8.19). Малонат ( ООС вЂ” СН,— СОО" ) способен связываться с дегидрогеназой, образуя комплекс Епх — 1. От С.-атома малоната отшепления атома водорода произойти не может. Комплекс Еы — 1 может только распадаться на свободный фермент и ингибитор. Для этой обратимой реакции Епх — 1 Й Ецио+1 — ! константа равновесия К, равна Ферменты: кинен1нка Сукцннат Фум врат О [8! Н 1 Н -С-СОО Н вЂ” С-СОО ! — 2Н -оос-с-н ~-оос-с-н Н авгнаро- Рне. 8.19. Сукцннатдегндрогеназная реакция.
Действие конкурентных ингибиторов можно представить в виде следующих реакций: Е ! (иваи Епг + Р— ТИВН.) а~ ®а Епкв(актипн) Епа + Р Скорость образования продукта — обычно именно она является объектом измерения — зависит только от концентрации комплекса Епх — Б. Предположим, что 1 очень прочно связывается с ферментом (К, мала). Тогда количество свободного фермента (Епх), который мог бы присоединять Б, образуя комплекс Епх — Б, а затем и Епх+ Р, будет весьма мало. Таким образом, скорость реакции (образования Р) будет мала. По аналогичным причинам при той же концентрации слабо связывающегося ингибитора (К, велика) катализируемая реакция существенно не замедлится. Предположим теперь, что при фиксированной концентрации ингибитора ! добавляется все большее количество субстрата Б.
Это повышает вероятность образования комплекса Епк — Б по сравнению с комплексом Епк — 1. С ростом отношения [Епх — Б!/[Епг — 1] будет расти и скорость реакции. При достаточно высокой концентрации Б концентрация комплекса Еы — 1 станет исчезающе мала. Но тогда скорость катализируемой реакции будет такой же, что и в отсутствие 1 (рис.
8.20). Рне. 8.26, График Лайнунвера — Бэрка для случая классического конкурентного ннгнбнрования. Обратите внимание на полное отсутствие ингнбнруннцего действия прн высоких значениях [Б)(низких значениях (!/[Б!). Графическая оценка копствнт конкурентного ивгибированив На рис. 8.20 приведен типичный случай конкурентного ннгибирования, представленный в форме графика Лайнуивера — Бэрка.
Скорость реакции (в) измеряется при разных значениях концентрации Б и при фиксированной концентрации ингнбитора. Прямые, проведенные через экспериментальные точки, пересекаются в одной и той же точке на оси у. Длина отрезка. отсекаемого от оси у, равна !/!' „; это означает, что при бесконечно большой концентрации Б (ЦЯ = О) и будет такой же, что и в отсутствие ингибитора. Однако длина отрезка, отсекаемого от оси х (а эта величина определяет значение Кы), в присутствии ннгибитора уменьшается ( — 1/К' < — 1/К„).
Таким образом, конкурентный иигибитор повышает кажущееся значение К„(К',„) для субстрата. Для простого конкурентного ингибирования длина отрезка, отсекаемого от оси к, будет равна Определив К в отсутствие 1, можно найти из этого уравнения К, Если концентрация добавленного 1 значительно превышает концентрацию фермента, то можно считать Щ равной концентрации добавленного ингибитора.. Значения К, для ряда аналогов субстрата (конкурентных ингибиторов) показывают, какой из них наиболее эффективен. Ингибиторы с наименьшими К даже при малых концентрациях могут оказывать сильное ннгибирующее действие. Многие лекарственные препараты, широко применяющиеся в клинике, действуют как конкурентные ингибиторы очень важных ферментов, функционирующих как в микробных, так и в животных клетках. Обратимое неконкурентное пнгибирпвапве Как следует уже из самого названия, в этом случае конкуренция между Б и 1 отсутствует.
При этом ннгибитор обычно ничем не напоминает Б и, как можно предположить, связывается с другим участком фермента. Обратимые неконкурентные ингибиторы понижают максимальную скорость, достижимую при данном количестве фермента (понижают $'„„), по, как правило, ие влияют иа К„. Поскольку 1 и Б связываются с разными центрами, возможно образование как комплекса Епг — 1, так и комплекса Еы — 1Б. Комплекс Епк — 1Б тоже распадается с образованием продукта, однако с меньшей скоростью, чем Епх — Б; поэтому реакция будет замедляться.
но не остановится. Таким образом, могут протекать сле- дующие конкурентные реакции: Епк Епк18- Епк+ Р Епк8 Епк + Р На рис. 8.21 представлена зависимость 1/о от 1/~Б) в присутствии и в отсутствие ингибитора (предполагается. что связывание ! не приводит к существенным изменениям в работе активного центра). Необратимое неконкурентное ингибирование Ферментативная активность может уменьшаться в присутствии многих «ядов», таких, как иодацетамнд, ионы тяжелых металлов (АВ'„НВт').
окисляющие агенты и т.д. В присутствии одного или нескольких субстратов или продуктов скорость инактивации фермента может снижаться. Тот кинетический анализ, о котором здесь шла речь, может оказаться недостаточным для того, чтобы отличить действие ферментных ядов от действия неконкурентных обратимых ин|ибиторов. Обратимое неконкурентное ингибирование встречается сравнительно редко. К сожалению. оно не всегда выявляется, по- скольку и обратимое, и необратимое неконкурент- ное ингибирование характеризуются сходной кине- тикой. МОДУЛЯТОРЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ Поток энергии и вещества (в виде атомов углерода) в ходе метаболизма зависит от процессов синтеза ферментов и активации проферментов.Однако процессы эти необратимы.
Как и все белки млекопитающих, ферменты распадаются на аминокислоты (обновление белков). В бактериальных клетках активность фермента может «разбавляться» из-за распределения его среди дочерних клеток, образующихся в результате последовательных делений. Хотя оба механизма приводят к уменьшению концентрации фермента и как следствие к уменьшению каталитической активности, идут такие процессы медленно н сопровождаются большими затратами вещества: представим себе по аналогии, что мы выключали бы свет, разбивая лампочку, а затем, чтобы снова его включить, вкручивали бы новую лампочку.
Ясно, что гораздо эффективнее регулировать активность фермента, «включая» и «выключая» его. Каталитическая активность некоторых ключевых ферментов действительно регулируется с помощью низкомолекулярных метаболитов (см. гл. 6). Низкомолекулярные модуляторы, подавляющие ферментативную активность, называют етрицательными медулятерами, а повышающие ее — пележительиыми.
Мы рассмотрим их в гл. 1О и в последующих главах. Рис. 8.21. График Лайиуивсра — Бэрка для случая обра ~и- мого неконкурентного ингибирования. ЛИТЕРАТУРА СГтгтвгепвеи О. Ж Р!ввос!айоп, Епвупте К1пейсв. В!оепег8ет1св, $ашн$егв, 1975. ЕикГе Р. С. Еноте Ктпе6св, %!1еу, 1977.
РЫг!и!сг !Э. К!пе6св оГСЬеппса1 апд Епгугпе-Сита!улет Кеас6опв, ОхГогд 13п!к. Ргевв, 1977. Беке! Г. Н. Епкуте Ктепсв, тЧ!1су, 1975. 5!8»яти !Э. о., Моовег б. СЬеписа1 вщйев оГ епкугпе асМе ятев, Апп. Кек ВюсЬегп., !975, 44, 889. гав Тат!еп Е.Е. ГетЦ Вюог8ап!с СЬетп!втгу, Чо!. 1, Епяутпе Ас6оп„1977; УоЬ 2, Масго- апд Ми!1!тпо1ес»1аг Бувтетпв, 1977; уо1. 3, ВпЬвтхате ВеЬаяог, 1978, Аскет!с ргевв. Глава 9 Ферменты: механизм действия Виктор Родуэлл ВВЕДЕНИЕ и-Ннтрофеиилацетат, полезный синтетический субстрат БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МЕХАНИЗМ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМОТРИПСИНА О 11 О=(Ч О Рие. 9Л. и-Ни1рофенилацетат.
В этой главе мы детально опишем каталитическое действие протеолитического фермента химотрипсина, чтобы проиллюстрировать принципы катализа, общие для всех ферментов. Чем обусловлены столь высокая каталитическая эффективность ферментов и их специфичность? Это одна из фундаментальных научных проблем, хотя некоторые ее аспекты имеют и прикладное значение. Переход неактивных проферментов в каталитически активное состояние, который наблюдается в клетках при определенных патологических условиях (например, при остром панкреатите), приводит к внутри- клеточному перевариванию и разрушению тканей.
Проводя фундаментальные иследования механизма действия ферментов, мы в конце концов сможем, используя технологию рекомбинантных ДНК и метод направленного точечного мутагенеза, систематически синтезировать ферменты с более высокой каталитической активностью или новой специфичностью. Некоторые из этих «синтетическихв ферментов могут оказаться мощными терапевтическими агентами.
Если мы хотим понять, как действуют металлы на биологические системы, мы тоже должны исследовать их влияние на работу ферментов. Природа н спецнфнчносп полной реакции Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связей, в которых карбоксильная группа принадлежит ароматической аминокислоте (Рпе, Туг или Тгр) или аминокислоте с объемной неполярной К- группой (Ме$). Как и многие другие протеазы, химотрипсин катализирует также гидролиз некоторых сложных зфи- ров. Эта его способность не имеет физиологического значения, но она успешно используется в экспери- ментах, направленных на детальное изучение меха- низма катализа.
Использование синтетического субстрата инитрофенилацетата (рис. 9.1) позволяет определять активность химотрипсина колоримегрическими методами, поскольку гидролиз и-нитрофенилацетата приводит к образованию п-нитрофенола, который в щелочной среде превращается в имеющий желтую окраску п-нитрофенолят-инион. Изучение кинетики методом остановленной струи Кинетику гидролиза л-нитрофенилацетата химотрипсином можно изучать с помощью так называемого метода остановленной струи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
