Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Многие ферменты характеризуются такими значениями К„, которые примерно соответствуют физиологическим концентрациям их субстратов. Уравнение Михаэлиса — Ментен Р' „(Я К + С81 описывает поведение многих ферментов при изменении концентрации субстратов.
Используя это уравнение, зависимость начальной скорости ферментативной реакции от [Б) и К„ можно проиллюстрировать на следующих конкретных примерах. Глава 8 8б у=ах+Ь, 1",„~Б~ К„+ [Б1 3паа 1 1 Км х= — — = — —. Км 1' -Р1 — — 1 мах [Б1 Р „[Б1 Км+ [Я' 1' „[Я Г „[Я ~Б3 + [Б3 2 [Б1 2 и 1',„[Б) К 1 [Б3 и $~,„~Я Ф',„[Я Км = — — + $~ „~Б1 1. [ЯмногоменьшеК (точкаАнарис.8.14н8.15).
В этом случае величину [Б1 в знаменателе можно опустить,и он будет практически равен К . Отношение двух констант, 1',„ и К , можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем: (= означает «примерно равно»). Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже той, при которой скорость реакции составляет половину максимальной (т.е. значительно меньше К„)„ начальная скорость к пропорциональна концентрации субстрата [Я. 2. [Б1 много больше Км (точка С на рис.
8.14 и 8.! 5). В этом случае член Км в знаменателе можно опустить, т.е. Это означает, что прн кояцентрацни субстрата [Я, намного превьппающей Км, начальная скорость и равна максимальной 1' .„. 3. [Я = К„(точка В на рис. 8.14 и 8.15). Это означает, что при концентрации субстрата, равной К,„, начальная скорость реакции к составляет половину максимальной. Отсюда же следует способ оценки К„: надо экспериментально определить концентрацию субстрата, при которой начальная скорость равна половине максимальной. Для многих ферментов определение 1' .„(а значит, н Км) непосредственно из графика зависимости и от Я оказывается затруднено.
Для этого используют уравнение, обратное уравнению Михаэлиса— Ментен, т. е. и представляют его правую часть в виде суммы двух слагаемых: Отсюда, упростив, получаем Итак, мы имеем уравнение прямой где у = 1/и и х = 1/[Б1. Если построить график зависимости у (т.е. 1/и) от х (т.е. 1([Б1), то длина отрезка Ь, отсекаемого от оси у, будет равна 1/1' „, а тангенс угла наклона а— Км/Р,„. Длину отрезка, отсекаемого от оси х (в области отрицательных значений), можно получить. приравняв у нулю.
Тогда График уравнения Михаэлиса — Ментен в обратных координатах называют графиком Лайнунвера— Бэрка (рис. 8.16). Используя его, Км можно найти либо из наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от осн у, либо из длины отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений от оси х. Поскольку [Б) имеет размерность молярной концентрации, К„тоже измеряется в молях на литр.
Скорость в может быть выражена в любых единицах, поскольку Км не зависит от [Епк4. График, построенный в обратных координатах, позволяет определить К„по относительно небольшому числу точек, именно поэтому он часто используется для нахождения Км. Используя график Лайнуивера — Бэрка на практике для оценки Км, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких концентраций субстрата. Это происходит в том случае, когда измерения проводят через равные интервалы [Б). Чтобы этого избежать, измерения следует проводить при таких значениях [Б], которые соответствуют равным интервалам по шкале обратных величин. Альтернативный подход к экспериментальной оценке К„и $~,„предложили Иди и Хофсти.
Уравнение Михаэлнса — Ментен можно преобразовать Рис. 8.1б. График Лвйнуиверв — Бэрка в двойных обратных координатах (зависимость 1/с„от 1/Щ), используемый для графического определения Км и $~ Ферменты: канатика к виду /г, »lс„ то Еы+ Б Й Епк — Б О О 22, 1 !',„ — — е — + [Б3 Км Км Чтобы найти К,„и Р' „, строят график зависимости 22/[Б1 (ось у) от 22 (ось х). Тогда длина отрезка, отсекаемого от оси у, будет равна !',„/К„, а отрезка, отсекаемого от оси х,— $~ „. Тангенс угла наклона равен — 1/Км. Уравнения Лайнуивера — Бэрка и Иди — Хофсти весьма удобны в некоторых случаях, однако для строгого определения К и !' .„требуется соответствующая статистическая обработка.
Оценки К„имеют практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих Ки, фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максямальвая скорость (Р.„) будет отражать количество присутствующего активного фермента, Это немаловажное обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Значение К„позволяет ориентироваться, какое количество субстрата следует добавить для определения Р „. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое применение при оценке действия ингибиторов.
Соотношение между К,» и К» — константой диссоциация фермент-субстратиого комплекса Сродство фермента к субстрату равно величине, обратной константе диссоциация К, комплекса Епг — Б: 1 Епх+ Б Епх — Б, е й К »вЂ” й, Иными словами, чем слабее выражена тенденция фермент-с убст ратного комплекса к диссоциации, тем выше сродство фермента к субстрату. Мерой К, может ориентировочно служить значе- ние К,„для данного фермента по отношению к его субстрату. Однако это возможно только в том слу- чае„если справедливо допущение, использовавшееся при выводе уравнения Михаэлиса — Ментен.
Оно со- стояло в том, что первая стадия ферментативной ре- акции идет быстро и при этом всегда на этой стадии поддерживается равновесие. Другими словами, скорость диссоциации Еы — Б на Епг + Б намного выше, чем скорость диссоциации на фермент + продукт: Епх — Б д Епх+ Р. Из уравнения Михаэлиса---Ментен следует, что величина [Б1, при которой 22 = — *, равна [Б1= ' й2+ й Но если и [Б1 = — К».
й, Прн этих условиях !/К„= 1'К, и равно сродству фермента к субстрату. Если А2+ /с, Ф / „то 1/К даст заниженную оценку сродства. ОГРАНИЧЕНИЯ, ПРИСУЩИЕ УРАВНЕНИЮ МИХАЭЛИСА — МЕНТЕН Некоторые ферменты и другие лигандсвязывающие белки, например гемоглобин (см. гл. 6 и 10), не подчиняются классической кинетике насыщения Михаэлиса — Ментен. График зависимости о от 1Б1 носит в этом случае сигмоидный характер (рис. 8.17). Это обычно указывает на кооперативное связывание субстрата многими центрами---связывание с одним центром влияет на связывание с другим, как это происходит с гемоглобином (гл.
6). Рис. 8.!7. Сигмоилная кинетическая кривая с иась~иениекс Глива 8 88 -4 850 -3 [Епх! [Ц 1~, [Епх — 13 й В таком случае описанный выше метод графической оценки концентрации субстрата, при которой скорость реакцчи составляет половину максимальной, оказывается непригодным (прямой в соответствующих координатах уже не получается). Здесь следует обратиться к графическому представлению уравнения Хилла, первоначально предложенного для описания кооперативного связывания О, с гемоглобином (гл.
б). Уравнение Хилла, преобразованное так, чтобы график в соответствуюших координатах представлял собой прямую, имеет вид 1о8 = и 1о8 [Я вЂ” !о8 й', !ювао где 1г' — константа. Из уравнения следует, что в условиях, когда [Я] мало по сравнению с lс', скорость реакции возрастает как и-я степень [Я. На рис, 8.18 приведен график Хилла, построенный по кинетическим данным для фермента, характеризующегося кооперативным связыванием субстрата.
График зависимости !о8 (и/!'„,„— и) от !о8 [Б! представляет собой прямую с тангенсом угла наклона, равным и, где и— эмпирический параметр, зависящий от числа субстратсвязываюших центров и характера взаимодействия между ними. При п = 1 связывающие центры не зависят друг от друга. При и > ! между центрами имеется кооперативное взаимодействие; чем больше и, тем выше степень кооперативности и тем более выражена сигмоидность кривых насыщения. При и < 1 говорят об отрицательной кооперативности.
Когда скорость реакции равна половине максимальной (п = Р „~2), пЯ1' — п) = 1 и !о8 [и/(!' „— — и)1 = О. Таким образом, чтобы определить величину В„(концентрацию субстрата, при которой скорость вдвое меньше максимальной), нужно из точки на прямой, для которой !о8 [сф~',„— и)! = О, опустить перпендикуляр на ось х. Рис. 8.18. Графический способ определения из уравнения Хилла концентрации субстрата, прн которой скорость реакции составляет половину максимальной, в условиях, когда кинетическая кривая носит сигмоидный харвктер. ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ Различают два больших класса ингибиторов ферментативной активности — конкурентные и неконкурентные — на основании того, ослабляется (конкурентное ннгибирование) или не ослабляется (неконкурентное ингибирование) их ингибируюшее действие при повышении концентрации субстрата.
На практике многие ингибиторы не проявляют тех свойств, которые характерны для чисто конкурентного илн чисто неконкурентного ингибирования. Другой способ классификации ингибиторов основывается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в том же месте, что и субстрат (в каталитическом центре), а другие — на значительном расстоянии от активного центра (в аллостерическом центре). Конкурентное иигибироваиие аиалогамн субстрата Классическое конкуретное ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязываюшим (каталнтическим) центром. Химическая структура аналога субстрата, действуюшего как ингибитор (1), обычно сходна со структурой субстрата (Б). Поэтому ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя вместо Епх — $ комплекс Епг — 1, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
