Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Впоследствии было выявлено много других случаев изменения относительного содержания изозимов при разных заболеваниях. Изозимы сывороточной лактатдегидрогеназы обнаруживаются после электрофореза при рН З,б на крахмальном, агаровом или полиакриламидном гелях. При указанном значении рН изозимы несут разный заряд и распределяются на электрофореграмме в пяти разных местах. Далее изозимы можно обнаружить благодаря их способности катализировать восстановление бесцветных красителей в нерастворимую окрашенную форму. Типичный набор реагентов для обнаружения изозимов дегидрогеназы включает: 1) восстановленный субстрат (например, лактат); 2) кофермент (1ЧАР'); 3) краситель в окисленной форме (например, голубая нитротетразолиевая соль); 4) переносчик электронов от АРАОН к красителю [например, феназннмегасульфат (ФМС)1; 5) буфер; активирующие ионы (если требуются).
Лактатдегидрогеназа катализирует перенос двух электронов и одного иона Н' от лактата к 1ЧАЕ1' Гяави 7 ОН О 1 я СН О- С О Г л Г" Г с Л'к' - Нзо з дагидроганатв я О О (= Лактат Лируват НАО НАОН+ Н Рвс. 78. Реакция, каталязируемая (.-лактатдегидро гена зой. (рис.
7.8). Если электрофореграмму опрыскать приведенной выше смесью и затем инкубировать при 37 С, то реакция сопряженного переноса электронов будет протекать только в тех местах, где присутствует лактатдегидрогеназа (рис. 7.9). Относительную плотность окраски полос можно далее оценить количественно с помощью сканирующего фотометра (рис. 7.10). Изозим с наибольшим отрицательным зарядом обозначают 1,. Физическая природа изозпмов Олигомерные ферменты, образованные разными протомерами, могут быть представлены несколькими формами. Часто определенная ткань продуцирует преимущественно один из протомеров.
Если активный' олигомерный фермент (например, тетрамер) может быть построен из таких протомеров в различных комбинациях, то образуются изозимы. Изозимы лактатдегидрогеназы различаются на уровне четвертичной структуры. Олигомерная молекула лактатдегидрогеназы (мол. масса 130000) состоит из четырех протомеров двух типов, Н и М (оба с мол.
массой около 34000). Каталитической актив- Лактат 8 (Лируват) ро (Лактат) ЗН (тАОН + Н+ (ЧАО+ Восстановлаинын ФМС Окисланный ФМС Окисланный краситель Восстаиовланный краситель (басцватный) (голубой Формааан) Рис. 7.9. Локализация лактатдегидрогеназы на злектрофореграммс с использованием системы сопряженных реакций. постыл обладает только тетрамерная молекула. Если порядок соединения протомеров не имеет значения, то протомеры могут быть скомпонованы пятью способами: НННН НННМ ННММ НМММ ММММ Маркерт подобрал условия для разрушения н реконструкции четвертичной структуры и сумел выяснить взаимоотношения между изозимами лактатдегидрогеназы.
Расщепление и реконструкция лактатдегидрогеназ 1, н 1, не приводят к образованию новых изозимов. Следовательно, эти два изозима содержат только один тип протомеров. Когда такой же процедуре была подвергнута смесь лактатдегидрогеназ 1, и 1„появились также формы 1„1, н 1,. Соотношение изозимов соответствует приведенному ниже субъединичному составу: Изозимы лактатдегид- Субъединичный состав роген азы 1, НННН 1, НННМ 1т ННММ 1, НМММ 15 ММММ Синтез Н- и М-субъединиц детерминнруется разными генетическими локусами, и они по-разному экспрессируются в разных тканях (например, в сердечной и скелетной мышцах). ФЕРМЕНТЫ В КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ Разлнчии между функциональными и нефункциональными ферментами плазмы Некоторые ферменты, проферменты и их субстраты в норме постоянно циркулируют в крови человека и выполняют физиологические функции.
Примерами функциональных ферментов плазмы являются липопротеинлипаза, псевдохолинэстераза, а также проферменты компонентов систем свертывания крови и растворения кровяного сгустка. Они синтезируются в печени, и их концентрация в крови либо такая же, как в тканях, либо более высокая. Как следует из названия, нефункциональные ферменты плазмы не выполняют в крови никаких известных физиологических функций. Их субстраты в плазме обычно не обнаруживаются, и в норме их концентрация в крови человека почти в миллион раз ниже, чем в тканях.
Появление этих белков в плазме в повышенных концентрациях указывает на повышенную скорость деструкции тканей. Таким образом, Фермептас обиде евийетвп б 4 З г 5 4 3 2 Рис. 7.10. Содержание изозимов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови в норме н патологии. Изозимы сывороточной ЛДГ разделяли методом электрофореза на ацетатцеллюлозе прн рН 8,6'и выявляли с помошью реакции, в результате которой образуется краситель. Фотометрическое сканирование пятен позволяет оценить относительное содержание изозимов. А. Сыворотка больного инфарктом миокарда.
Е. Сыворотка здорового человека. В. Сыворотка пациента с заболеванием печени. 1С любезного разрешения Ог. Ме1чп В1ас1с апов Мг. Н~щй М11!ег, Б1 1.пке'з Нозрйа!, Бап ггапазсо.) измерение в крови уровня нефункциональных ферментов плазмы дает врачу ценную диагностическую и прогностическую информацию. Нефункциональные ферменты плазмы включают белковые секреты экзокринных желез и истинно внутриклеточные белки. Ферменты, выделяемые экзокрннными железами,— панкреатическая амилаза, панкреатическая липаза, щелочная фосфатаза (из желчи) и кислая фосфатаза из простаты— поступают в плазму путем простой диффузии. Истинно внутриклеточные белки в норме в систему кровообращения не поступают.
Происхождение нефункциональных ферментов плазмы Нефункциональные ферменты, обычно обнаруживаемые в плазме в малых количествах, повидимому, появляются в ней вследствие нормально идущих процессов разрушения эритроцитов, лейкоцитов и других клеток. При ускорении гибели клеток в кровоток поступают растворимые ферменты. Именно с этим процессом обычно связывают повышение содержания ферментов в плазме, но поступлением в плазму значительных количеств мышечных ферментов сопровождается и выполнение тяжелой физической работы. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Практикующие врачи уже используют количественные определения некоторых нефункциональных ферментов плазмы. Получение этой ценной диагностической и прогностической информации теперь во многих случаях полностью автоматизировано.
В табл. 7 3 приведен перечень ферментов, которые используются в диагностической энзимологии. Дальнейшие детали, касающиеся их использования, приведены в Приложении, где рассматриваются также вопросы, связанные с чувствительностью и специфичностью диагностических тестов. ПРИМЕНЕНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ Диагностика генетических заболеваний получила мощный стимул благодаря последним достижениям в технологии рекомбинантных ДНК. Уже давно известно, что все наследственные болезни обусловлены изменениями в ДНК, однако методы прямого определения нуклеотидной последовательности ДНК появились лишь в последнее время. Например, на основе гибридизационного поиска фрагментов ДНК 1Бои1пегп, 1975) удалось разработать достаточ- Глава 7 Таблица 7.3.
Основные ферменты сыворотки. используемые в ллннической диагностике. Многие нз приведенных ферменз он не являются специфичными для указанных в таблице заболеваний: дополнительные данные об условиях, при которых активность этих ферментов изменяется, приведены в Приложении Заболевание Фермент Аминотрангтрвразы Аспартатаминотрансфераза Аланинаминотрансфераза Амнлаза Церулоплазмин Инфаркт миокарда Вирусный гепатит Острый панкреатнт Гепатолентикулярная дегенерация (болезнь Вилсона) Заболевание мышц н инфаркт миокарда Различные заболевания печени Инфаркт миокарда Креатинфосфокиназа у-Глутамилтранспептидаза Лактатдегидрогеназа (изозимы) Липаза Кислая фосфатаза Острый панкреатит Метастазирующая карцинома предСтательной железы Различные заболевания костей„ закупорка протоков печени Щелочная фосфатаза (изозимы) но чувствительный метод пренатального скрининга наследственных нарушений; с этой целью с помощью ферментов рестрикции проводят картирование ДНК„ извлеченной из зародышевых клеток, находящихся в амниотической жидкости.
В принципе можно сконструировать пробы ДНК для диагностики большей части генетических заболеваний. Например, для пренатального выявления талассемии (нарушения в синтезе субъединиц гемоглобина; см. гл. 6) можно синтезировать пробу ДНК по фрагменту гена, кодирующего нормальную субьединицу гемоглобина, и с ее помощью выявить укорочение или отсутствие рестрикционного фрагмента, обусловленное делецией в этом гене. Именно такие делеции характерны для некоторых видов а- талассемии и нескольких редких типов ~3- и ~3,5- талассемии (Ооху, Ропп ап, АЬце)о, 1979; Кап, СЬап8, Ооху, 1982).
Предложен и альтернативный подход, основанный на конструировании синтетической кДНК, гибридизующейся с ~3-глобиновой последовательностью, которая содержит нонсенс- мутацию, характерную для некоторых видов 13- талассемии (Р)гавщ е( а1., 1984). Отсутствие в плазме а,-антитрипсина — ингибитора протеаз — приводит к развитию эмфиземы и раннему циррозу печени. Неактивный а,-антитрипсин был обнаружен с помо- щью ДНК-зонда, сконструированного на основе неактивного мутантного аллеля гена а,-антитрипсина (КкЫ е1 а1., 1983). Гибрндизационные зонды могут использоваться также для обнаружения генетических изменений, ведущих к потере рестрикционного сайта (см. гл. 38). Например, при серповидноклеточной анемии наблюдается точечная мутация в кодоне ОАО (О1ц), в результате которой появляется кодон (лТ(Б (Ча1); такую мутацию в ~3-глобиновом гене можно обнаружить, взяв для анализа всего 1О мл амниотической жидкости и используя эндонуклеазу рестрикции Мз( П или Бац 1 (ОгЫп ет а1., 1982).
ДНК-зонды можно использовать и для обнаружения последовательностей ДНК, прочно сцепленных с интересующим нас геном, но не принадлежащих самому этому гену. Подобный анализ может применяться и для выявления хромосомного полиморфизма (различий в последовательностях гомологичных хромосом). Расщепление ДНК эндонуклеазой рестрикции дает в таких случаях неодинаковые рестрикционные карты (наборы фрагментов ДНК), свидетельствующие о различиях в последовательностях оснований гомологичных генов.
Это явление получило название полиформизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). При рестрикционном анализе обнаруживаются две гибридизационные полосы (если бы гены были идентичны, наблюдалась бы только одна полоса). У потомков, унаследовавших дефектную хромосому, тоже выявляется одна гибридизационная полоса, но ее положение отличается от положения полосы нормальных хромосом. Феномен ПДРФ применялся и для обнаружения гена серповидноклеточной анемии (сцепленного с сайтом рестрикции Нра 1), а также ~3-талассемии (сцепленного с сайтами рестрикции Нпй 111 и Ваш Н1) (1лц1е е( а1., !980; %оо е( а1., 1983). Скрининг, основанный на полиморфизме рестрикционных фрагментов, использовался также для ранней диагностики фенилкетонурии (%оо е1 а1., 1983) (см. гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
