Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Высокоочищенные препараты ферментов необходимо иметь также и для того„чтобы получить надежные данные о кинетике, кофакторах, активных центрах, о структуре и механизме действия ферментов. Процесс очистки состоит в выделении данного фермента из грубого клеточного экстракта, содержащего множество других компонентов. Небольшие молекулы удаляются диализом или гель- фильтрацией; нуклеиновые кислоты — осаждением путем добавления антибиотика стрептомицина и т.д.
Основная проблема — отделить нужный фермент от сотен химически и физически сходных белков. Классические методы очиеткн Широко используются следующие методы очистки: осаждение при различных концентрациях солей (чаще всего сульфата аммония или сульфата натрия), а также органическими растворителями (ацетоном, этанолом); дифференциальная денатурация путем нагревания или изменения рН; дифференциальное центрифугирование, гель-фильтрация и электрофорез.
Для масштабной и быстрой очистки белков успешно применяются избирательная адсорбция и элюция белков с целлюлозного анионообменника диэтиламинозтилцеллюзлозы и катионообменника карбоксиметилцеллюлозы. Широко используется также разделение белков по размерам на молекулярных ситах, например сефадексе. Эти методы являются, однако, относительно малоселективными (если онн не используются в сочетании) для отделения индивидуального белка от всех остальных, находя- шихся в смеси.
Такая задача легче решается методом аффинной хроматографии. Типичная процедура очистки одного из ферментов печени с хорошим выходом и 490-кратной степенью очистки препарата описана в табл. 7.2. Обратите внимание на изменение при очистке удельной активности и выхода фермента. Процедура направлена на то, чтобы достичь максимальной удельной активности (число единиц активности фермента на 1 мг белка) при возможно большем выходе исходной суммарной активности. Глава 7 Суммарный белок, мг Выход, % Фракция, содержащая фермент Суммарная активность, рх) Удельная активность, рг)/мг 10 000 1О (100) 12.2 1500 250 58 2600 4160 4900 52 50 49 52 000 50 000 49 000 20 12 1О Таблица 7.2.
Типичная процедура очистки фермента Грубый гомогенат печени Супернатант после центрифугнровання при ! 00000 К Осадок, образующийся и 40 — 50%-ном (Х На)гБОа Осадок, образующийся в 20 — 35%-ном ацетоне Фракции 80 †1 после хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой Осадок, образующийся в 43 — 48%-ном (ХН4).
8О. Первая кристаллизация Перекристаллизация Метод аффииной хроматографии Замечательным достоинством этого метода очистки является то, что он позволяет избирательно извлекать из сложной смеси белков один конкретный белок или по крайней мере небольшое их число. Метод основан на использовании иммобилизованного лиганда, который специфически взаимодействует с тем белком, который требуется пдлучить в очищенном виде. Из всех белков, присутствующих в смеси, с этим иммобилизованным лигандом связываются только те белки, которые способны вступать с ним в сильное взаимодействие.
После удаления всех прочих несвязавшихся белков нужный фермент элюируют с иммобилизованного лиганда либо концентрированными солевыми растворами, либо раствором, содержащим растворимую форму лиганда. Успешное применение метода аффинной хроматографии позволяет добиться в ходе очистки поразительных результатов, обычно превосходящих результаты последовательного применения многочисленных классических методов. Чаше всего ферменты проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам и коферментам, поэтому наиболее подходящими лигандами служат производные субстратов и коферментов, ковалентно связанные с носителем, например с сефадексом. Они могут быть присоединены к носителю либо непосредственно, либо через связующую «ножку» (линкер) из 3 — 8 атомов углерода.
Использование линкера помогает разрешить проблемы, связанные с тем, что присоединение лиганда к носителю может препятствовать его взаимодействию с ферментом. Вместе с тем введение гидрофобного линкера иногда осложняет выделение из-за проявления эффектов хроматографии на гидрофобных лигандах (см. ниже). Примером успешного применения аффинной хроматографии может служить очистка множества различных дегидрогеназ на аффинных носителях с )ЧАВ в качестве лиганда.
При этом с лигандом могут связываться несколько дегидрогеназ, которые при элюировании их раствором НАР ' выходят вместе, и их дальнейшее разделение проводят, используя уже не коферментные, а субстратные аффинные носители или применяя для элюирования «тупиковые тройные смеси», содержащие кофермент, специфический субстрат и специфический продукт. С аффинной хроматографией во многом сходна хроматография, при которой в качестве лигандов используются красители (голубая, зеленая или красная сефароза), а также хроматография на гидрофобных лигандах, где носителем является октил- или фенилсефароза.
В первом случае в качестве иммобилизованного лиганда используют органический краситель, являющийся аналогом субстрата, кофермента или аллостерическ ого эффектора. Элюирование обычно осуществляют соленым раствором увеличивающейся концентрации. В случае хроматографии на гидрофобных лигаидах к носителю (например, сефадексу) присоединяют алкильные или арильные углеводороды.
Связывание белков с такими носителями обусловлено гидрофоб- ными взаимодействиями между алкильными цепями и гидрофобными участками белковой молекулы. Белки наносят в составе растворов с высоким содержанием соли, например (ХН,), БОге и элюируют раствором с понижающейся концентрацией этой же соли. Определение гомогенности белкового препарата с помоп1ъю электрофорезв в поливкрилвмпдном геле Гомогенность белковых препаратов лучше всего устанавливать с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в разных условиях. Прн одномер- Ф~рл~енты: общ1«сеой~тво ном электрофорезе нативного белка (при наличии достаточного количества препарата) можно обнаружить как основные, так и минорные белковые примеси. В двумерном варианте (по О'Фаррелу) в одном направлении проводят разделение денатурированных белков в соответствии с их значениями р1 (в присутствии мочевины) в градиенте рН, который создается полимеризованными амфолитами.
Во втором направлении белки, денатурированные с помощью додецилсульфата натрия, разделяют в соответствии с размерами протомеров (если белок является олигомером). ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ Пространственное распределение и клеточная компартментация ферментов, субстратов и кофакторов (см. гл. 2) имеют кардинальное значение. Например, в клетках печени ферменты гликолиза локализованы в цитоплазме, а ферменты цикла лимонной кислоты — в митохондриях. Распределение ферментов по субклеточным органеллам изучают после предварительного фракционирования клеточных гомогенатов путем высокоскоростного центрифугирования, определяя содержание ферментов в каждой фракции (см. гл. 2).
Локализацию данного фермента в ткани или клетке часто удается установить 1п я 1 и гистохимическими методами («гистоэнзимология»). Для этого тонкие (от 2 до 10 мкм) срезы замороженной ткани обрабатывают раствором субстрата, к которому специфичен данный фермент. В тех местах, где находится фермент, образуется продукт катализируемой этим ферментом реакции. Если продукт окрашен и нерастворим; он остается на месте образования и позволяет локализовать фермент. Гистоэнзимология дает наглядную и в известной мере физиологичную картину распределения ферментов.
ИЗОФЕРМЕНТЫ (ИЗОЗИМЫ) Когда мы говорим «малатдегидрогеназа» или «глюкозо-б-фосфатаза», то обычно имеем в виду конкретный белок, обладающий форментативной активностью, однако в действительности эти наименования охватывают все белки, катализирующие окисление малата в оксалоацетат или гидролиз глюкозо-б-фосфата с образованием глюкозы и Р,. В частности, после выделения малатдегидрогеназы из различных источников (печени крысы, Е.
сой) обнаружилось, что ферменты из печени и фермент из Е. сой, катализирующие одну и ту же реакцию, различаются во многих отношениях по своим физическим и химическим свойствам. Физически различимые формы ферментов, обладающие одним и тем же видом катал итической активности, могут присутствовать в разных тканях одного организма, в разных типах клеток одной ткани и даже в прокариотическом организме, например в Е. сой. Это открытие было сделано благодаря применению электрофоретических методов разделения белков, в результате чего были обнаружены зле ктрофоретически разные формы определенной ферментативной активности.
Термин «изофермент» («изозим») охватывает все вышеупомянутые физически различимые белки с данной каталитической активностью, однако на практике, и особенно в клинической медицине, его употребляют в более узком смысле, подразумевая физически различимые и поддающиеся разделению формы данного фермента, присутствующие в различных типах клеток данного эукариотического организма, например человека. Изозимы неизменно обнаруживаются в сыворотке и в тканях всех позвоночных, насекомых и в одноклеточных организмах.
При этом число ферментов и их содержание сильно варьируют. Известны изоферментные формы дегидрогеназ, оксидаз, трансаминаз, фосфатаз, трансфосфорилаз и протеолитических ферментов. В различных тканях могут находиться разные изоферменты, и эти изоферменты могут иметь неодинаковое сродство к субстратам. Диагностическое значение изозимов Медицинский интерес к изозимам возник после того, как было обнаружено, что сыворотка человека содержит несколько изозимов лактатдегидрогеназы и что их относительное содержание значительно изменяется при определенных патологических состояниях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
