Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Например, ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот, нуждаются в коферментах — производных витамина В,. Витамины группы  — 'иикотииямид, тиамии, рибофлавии и павтотеиовая кислота — являются компонентами коферментов, участвующих в процессах биологического окисления и восстановления, а коферментные формы фолиевой кислоты и иобамида участвуют в переносе одноуглеродных фрагментов.
Структурный компонентом многих коферментов является адениновое кольцо, соединенное с Р- рибозой и неорганическим фосфатом. Эти коферменты можно рассматривать, следовательно, как производные аденозинмонофосфата (АМР) (см. табл. 34,Ц. Структурные формулы НАР' и 1ч(АРР' приведены на рис. 7.2. «ТРЕХТОЧЕЧНАЯ ФИКСАЦИЯ» СУБСТРАТОВ НА ФЕРМЕНТАХ Большинство субстратов образует по меньшей мере три связи с ферментом. Благодаря такой «трехточечной фиксациив симметричная молекула может проявлять асимметрию.
Чтобы это пояснить, представим область фермента, связывающую субстрат, как участок плоской поверхности (хотя, как мы вскоре увидим, субстратсвязывающая «площадка» фермента редко бывает плоской, а возможно, и не бывает совсем). На рис. 7.3 молекула субстрата представлена в виде атома углерода с заместителями, три из которых взаимодействуют с тремя точками на плоском участке поверхности фермента.
Если молекула субстрата может подойти к этому участку только с одной стороны и взаимодействовать могут й ( ~)Г" мн, о — сн, — о он он о=р о=в-о — с 1 он но оЯ Рис. 7.2. 1ЧАР(Р) ', К = Н (в случае 1ЧА0+) или ОРО',(в случае 1чАОР+). Фермеиткс общие свойство 67 Субстрат Участок ооаараности фармйнта Рис. 7.3. «Трехточечная фиксвцияв субстрата нв плоском активном цен1ре фермента. только комплементарные структуры субстрата н фермента (в реальных ферментах оба этих условия соблюдаются)„то молекула субстрата може~ связываться с ферментом единственным способом, даже если группы 1 и 3 идентичны. Перебирая мысленно все возможные пространственные ориентации молекулы субстрата, мы можем убедиться, что с тремя точками плоской поверхности (с одной и той же стороны) молекула может связаться только в одной ориентации. Отсюда следует, что группы 1 и 3, хотя они и идентичны, при связывании с ферментом становятся неэквивалентными из-за различия в их окружении Химические изменения будут происходить только с группой 1, но не с группой 3 (или наоборот).
Обобщая эти рассуждения, мы можем объяснить теперь, почему ферментативное восстановление оптически неактивного пирувата приводит к образованию именно 1.-, а не Р, 1.-лактата, СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Способность фермента каталнзнровать одну н только одну специфическую реакцию является, пожалуй, наиболее важным его свойством. Благодаря этому скорости специфических метаболических процессов могут регулироваться путем изменения каталитической активности специфических ферментов.
Правда, многие ферменты катализируют реакции одного типа (перенос фосфата, окисл ительно-восстановительные реакции и т.д.), субстратами при этом является небольшое числа структурно сходных соединений. Реакции с альтернативными субстратами происходят в тех случаях, когда эти субстраты присутствуют в высоких концентрациях. Протекают ли в живых организмах все реакции, возможные при участии данного фермента, зависит от относительной концентрации альтернативных субстратов в клетке и относительного сродства фермента к этим субстратам. Ниже мы рассмотрим некоторые общие аспекты специфичности ферментов.
Оптическая специфичность ферментов За исключением эпнмераз (рацемаз), которые катализируют взаимопревращение оптических изомеров, ферменты в общем случае проявляют асболютную оптическую специфичность, по крайней мере по отношению к одному нз участков молекулы субстрата. Так, ферменты гликолнтического и прямого окислительного пути катализируют превращения только Р-, но не 1 -фосфосахаров. За единичными искл:очениями (например, почечная оксидаза Р-аминокислот) большинство ферментов млекопитающих катализирует превращение только Е-изомеров аминокислот.
Оптическая специфичность может относиться как к фрагменту молекулы, так и к молекуле в целом. Иллюстрацией служит специфичность гликозидаз. Эти ферменты катализируют гидролиз гликозидных связей между сахаром и спиртовой группой: онн высокоспецифичны как к сахарному фрагменту, так и к характеру гликозидной связи (ц или !3), но относительно неспецифичны к спиртовому фрагменту молекулы. Группоспецнфнчиость ферментов Литические ферменты действуют на специфические химические группировки: гликозидазы — на гликозидные связи, пепснн и трипснн — на пептидные связи, эстеразы — на сложноэфирные связи. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов — иначе их потребовалось бы намного больше.
Многие протеазы способны также катализировать гидролиз сложных эфиров. Хотя способность протеаз гидролизовать сложноэфирные связи не имеет физиологического значения, использование сложноэфирных синтетических субстратов для изучения механизма их действия оказалось весьма ценным. Отдельные литические ферменты отличаются более высокой группоспецифичностью. Так, химотрипсин гидролизует преимущественно пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит ароматическим аминокислотам — фенилаланину, тирозину или триптофану. Карбоксипептидазы и аминопептидазы отщепляют аминокислоты по одной с карбоксильного или с амина-конца соответственно.
Некоторые оксидоредуктазы способны использовать в качестве акцепторов электронов и НАР", и МАРР', но большая их часть использует только один из них. Обобщая, можно сказать, что окендоредуктазы млекопнтающнхт которые участвуют в'бноспнтетнческнх процессах (например, в синтезе жирных кислот нлн стероидов), обычно используют в качестве восстановителя ХАРРН, тогда как ферменты, уча- Глава 7 О,а й к о,а 0,4 о 0,2 О, 0,80 2,0 1,0 Времв, мин ствующие в процессах расщепления (гликолиз, окисле- ние жирных кислот), в качестве окислителя исполь- зуют преимущественно ХА13+.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ Ферменты в отличие от органических или неорганических веществ присутствуют в клетках в чрезвычайно малых количествах, н определение их содержания в тканевых экстрактах или жидкостях представляет особую проблему. К счастью, весьма чувствительные и специфичные методы оказалось возможным создать на основе определения каталитической активности ферментов.
Чтобы оценить количество фермента в пробе тканевого экстракта или биологической жидкости, измеряют скорость реакции, катализируемой содержащимся в этой пробе ферментом. При определенных условиях измеряемая скорость пропорциональна количеству присутствующего фермента. Поскольку при этом трудно определить число молекул фермента в пробе или их общую массу, результаты выражают в условных единицах активности фермента. Далее сравнивают относительные количества фермента в различных экстрактах.
Единицы активности удобнее всего выражать в микромолях (мкмоль, 10' моль), наномолях (нмоль, 10 ' моль) или пикомолях (пмоль, 10- " моль) израсходованного субстрата или образовавшегося продукта за единицу времени (в минуту). Соответствующие международные единицы активности ферментов обозначаются фЗ, п$3 или р1).
Пример количественного иивлизв фермеитативиой активности; определение содержания дегидрогеивзы При измерении скоростей реакций, протекающих с участием НАР' илн ЖАРР+ (реакции катализируются дегидрогеназами), можно воспользоваться тем обстоятельством, что ХА13Н и ХАЕН (но не ХАЙ)' н ИАРР ) поглощают свет с длиной волны 340 нм (рис. 7.4).
Окисление МАРН в ХАЮ+ (или обратный процесс) сопровождается изменением оптической плотности (О) растворов при 340 нм, и при определенных условияхскоростьизменения В оказывается пропорциональна активности фермента (рис, 7.5). Для получения калибровочной кривой (рис. 7.6) строят график зависимости скорости изменения оптической плотности (наклона прямых на рис. 7.5) от объема добавленного ферментного препарата. Количество фермента, присутствующего в исследуемом растворе, можно найти по наблюдаемой скорости изменения О при 340 нм. 200 250 ЗОО зао 400 длина аопнм.
нм Рис. 7.4. Спектры поглощения )чАО' н )чАОН. Концентрация растворов 44 мг(л, длина оптического пути 1 см. Аналогичные спектры имеют )чАОР+ и )чАОРН соответственно. Сопряженный ферментиый анализ В предыдущем примере оценка ферментативной активности основывалась на измерении скорости образования продукта (АРАОН). Скорость образования продукта (илн, реже, скорость расходования суб- Рис.
75. Принцип измерения активности )чАОН- нли ХАОРН-зависимой дегндрогеназы. Измеряют скорость изменения оптической плотности при 340 нм, обусловленного превращением восстановленного кофермента в окисленную форму. В кювету добавляют окисленный субстрат (Б), восстановленный кофермент н буфер и регистрируют поглощение при 340 нм. Вначале наблюдается высокая оптическая плотность нз-за сильного поглощения АРАОН (илн ХАОРН).
Прн добавлении 0,025- 0,2 мл стандартно~ о раствора фермента оптическая плотность понижается. Ферменты: общие гвойгтва 0.10 ст к аа 5 Я- 0,05 и а Глюкоаа Атр мял+ АОР, МдЯ+ Г юрко то.бфосфат гн Н+ 6-фос4югпюконопактсм 0 0.05 0,10 0,15 0,20 Овъам растаора фарманта. мл Рис.
7.б. Калибровочная кривая для определения количества ферменга. По осн ординат отложен тангенс угла наклона прямых, приведенных на рис. 7.5, по оси абсцисс— количество фермента. стрита) можно использовать для определения активности не только дегидрогеназ, но и других ферментов. Конкретный метод количественной оценки диктуется физико-химическими свойствами продукта или субстрата. Во многих случаях бывает удобно подвергать образовавшийся продукт реакции действию дегидрогеназы, для которой этот продукт является субстратом (рис.
7.7). Рис. 7.7. Определение активности гексокинаэы в системс, в которой протекает сопряженная ферментативная реакция, каталиэируемая глтокоэо-б-фосфатдегидрогенаэой. Глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа, глюкоза„АТР, Мй" и 1чАОР' добавлены в избытке. В этих условиях скорость общей сопряженной реакции зависит от количества добавленной гексокинаэы. Эту скорость определяют по образованию 1чАОРН, который поглощает свет при 340 нм. ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ Вся информация об отдельных метаболических реакциях, о промежуточных соединениях, образую- шихся на последовательных этапах различных метаболических путей, а также о механизме регуляции работы катализаторов получена главным образом с использованием очищенных препаратов ферментов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
