Biokhimia_cheloveka_Marri_tom_1 (1123306), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Метод состоит в смешивании примерно эквимолярных количеств фермента и субстрата и немедленном (в течение несколько миллисекунд) измерении. Растворы реагентов заливают в два шприца и с помощью механического устройства одновременно и практически мгновенно выталкивают их в очень узкую трубку. проходящую через спектрофотометр. На экран осциллографа выводятся данные об оптической плотности как функции времени, прошедшего с момента смешивания. Г.тини 9 4 в й О ! Еяг — СН,ОН + р — Р= дифф Стационарная фааа ' Время, мс феноя Н20 А Быстро Быстро Рис.
9.2. Кинетика освобождения и-нитрофснолят-аннана в ходе гилролиза я-нитрофснилацстата химотрипсином. регистрируемая методом остановленной струи. Количество выделившегося и-нитрофснола определяется путем измерения оптической плотности. Двухфазпьй характер гидролиза и-нитрофеяилацетата Кинетическая кривая образования инитрофенолят-аниона имеет две четко различающиеся фазы !рис. 9.2): 1) фаза «выброса», характеризующаяся бьгстрым образованием инитрофенолят-аниона; 2) последующее медленное образование еше некоторого количества инитрофенолят-аниона. Образование и распад фермент-субстратного комплекса Двухфазный характер образования инитрофеиолят-аниона можно объяснить, рассматривая последовательные стадии катализа, приведенные на рис.
9.3. Медленная стадия представляет собой гидролиз химотрипсин-ацетатного комплекса 1ХТ-Ац), После того как весь имеющийся химотрипсин перейдет в состав комплекса, выделение и-нитрофенолят-аниона замедлится из-за отсутствия свободного фермента, который освобождается лишь по мере медленного отщеплеиия от комплекса ацетат-иона (рис. 9.3). Фаза «выброса» и-нитрофенолят-аниона (рис. 9.2) соответствует переходу всего имеющегося Хт+ ПНф — Хт-ПНф Хт-Аа Хт Рис.
9.3. Промсжуточныс сталин кагализирусмого химотрипсином г идролиза и-нитрофсаилацстата. ХТ— химотрипсин„ПНФ вЂ” и-нитрофенилацстат; ХТПНФ комплекс химотрипснна с и-нитрофенилацетагом: ХТ-Ац --ацегилхимотрипсин„фснол. "и-нитрофснолят-авион; Ац ' — ацстат-нинон. Образование комплекса ХТ-ПНФ'и ацстилфсрмента ХТ-Ац идет намного быстрее гидролиза ХТ-Ац. нр О ~ — е Еяа СН вЂ” О- Р— О ! Рис. 9 4. Реакция [ ндроксила йсг 195 в составе хнмо~рипси- на с диизопропилфторфосфагом (ДИФФЬ химотрипсина в состав комплекса ХТ-Ац с одновременным образованием и-нитрофенолят-аниона.
Освобождение этого продукта сразу вслед за быстрой фазой обусловлено медленным высвобождением химотрипсина в процессе гидролиза комплекса ХТ-Ац. Этот свободный химотрипсин снова включается в реакцию образования комплексов ХТ-ПНФ и ХТ-Ац„сопровождающуюся вьщелением и-нитрофенолят-аниона. Количество выделившегося и-нитрофенолят-аниона прямо пропорционально числу молей химотрипсина, присутствующего в смеси. Роль 1зег 195 в катализе Ацильная группа, входящая в состав интермедиата ацил-ХТ„связана с высокореакционноспособным остатком серина--5!ег 195. Особая роль и высокая реакционная способность Бег 195 проявляется в способности этого остатка (отсутствующей у остальных 27 сериновых остатков химотрипсина) вступать в реакцию с диизопропилфторфосфатом 1ДИФФ) (рис.
9.4). Аналогичные реакции характерны и для других сериновых протеаз. При модификациии Бег 195 химотрипсин инактивируется. По аналогичному механизму в присутствии ДИФФ происходит инактивация и ряда других протеаз. Все они называются сериновыми протеаза- Система перекоса заряда В ходе катализа в молекуле химотрипсина функционирует система переноса заряда, которая служит каналом переноса протона.
Эта система включает три аминокислотных остатка, далеко отстоящих друг от друга в первичной структуре, но сближенных в рамках третичной структуры до расстояний, допускающих возможность взаимодействия. Этими остатками являются Акр!02, Нга 57 и Бег 195. Хотя в химотрипсине большинство заряженных остатков находится на поверхности молекулы, остатки, из которых формируется система переноса заряда, укрыты во внутренней неполярной части молекулы. Три упомянутых остатка образуют цепочку Аар102 ... Н!а 57 ....
Бег 195. 9З Фер41ентв1: механизм действия О !! Г~Ъ вЂ” С вЂ” О " Н вЂ” )Ч~ !Ч ° ° * Н вЂ” Π— Ябг аа ~ ~ !ч* Н>6 Стб !3.9.Ац ! !! — С вЂ” Π— Н . ° ° И )Ч вЂ” Н О вЂ” Я6! — 1 1 !3 1416 16 !46 !49 '"' пр6-хт ! 13 !4 16 16 146~ ~ 149 '" 6-хт Профермеиты !3 16 146 149 946 а-ХТ С Рис. 9.7. Схема внутри- и межпепочечиых лисульфилных связей в а-химотрипсиис (а-ХТ). Рис. 9.5. Функаиоиироваиие системы переноса протопоп а химотрипсине при апилироаании остатка Бег ! 95 субстратом (Суб ). Напомним, что Бег 195 — это тот самый остаток, который в ходе катализа подвергается ацилированию. Сближение ацегат-аниона (образующегося из и-нитрофенилацетата) с атомом кислорода К- группы Бег 195 приводит к последовательному переносу протона от Бег195 к Н1357 и далее к Акр 102 (рис.
9.5). В ходе деацилирования комплекса ацил-Бег!95 протон перемешается в обратном направлении. Аналогичный перенос протона, как полагают, происходит и при гидролизе физиологических субстратов химотрипсина †пептид. РОЛЬ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ПРОТЕОЛИЗА В ФОРМИРОВАНИИ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ ФЕРМЕНТОВ Превращение прохимотриисииа в химотрипсии Прохимотрипсин — это полипептид, состоящий из 245 аминокислотных остатков. Его превращение в активный фермент, а-химотрипсии, начинается с протеолитического разрыва, приводящего к образованию каталитически активного л-химотрипсина (л-ХТ), который далее протеолитически расщепляется еще в трех местах (рис.
9.6). В а-химотрипсине цепи А, В и С (рис. 9.б) остаются связанными друг с другом двумя межцепочечными дисульфидными связями (рис. 9.7). Многие белки синтезируются и секретируются в форме неактивных белков-предшественников, которые называют пробелками. В тех случаях, когда белки являются ферментами, пробелки называют прафермеитами или зимогеиами. Превращение про- 8 — Я белка в зрелый белок осуществляется путем избирательного протеолиза.
В пробелке происходит один или несколько последовательных протеолитических разрывов, после чего появляется характерная для зрелого белка активность (например, ферментативная). К числу белков, синтезируемых в виде пробелков, относятся гормон инсулин (его пробелком является проинсулин), пищеварительные ферменты пепсин, три псин и химотрипсин (пробелки— пепсиноген, трипсиноген и химотрипсиноген), несколько факторов каскадных систем свертывания крови и растворения кровяного сгустка (см.
гл. 55), белок соединительной ткани колл аген (пробелок— проколла ген). Почему некоторые белки секретируются в неактивной форме? Дело в том, что есть два типа белков. Одни из них необходимы практически постоянно, надобность же в других (например, ферментах, участвующих в образовании и растворении кровяного сгустка) возникает лишь эпизодически. Однако когда в этих, в норме отсутствующих, ферментах возникает реальная потребность, они оказываются необходимыми немедленно.
Некоторые физиологические процессы, например пищеварение, тоже не идут непрерывно, но они более или менее регулярны и предсказуемы (правда, у первобытного человека это могло быть и не так). В других случаях (например, при образовании кровяного сгустка, при его растворении или при восстановлении поврежденной ткани) физиологические процессы являются непосредственной реакцией на внезапно возникшие физиологические потребности организма или патологические состояния. Понятно, что процессы образования кро- Рис. 9.6. Схема превращения прохимотрнпсина (про-ХТ) в л-химотрипсии (л-ХТ) и далее а зрелый, каталитичсски активный а-химотрипсии (а-ХТ).
Годви 9 Неупорядоченное вяного сгустка и его растворения должны быть скоординированы„чтобы был достигнут гемостаз. Наконец, следует указать. что синтез протеаз в виде каталитически неактивных предшественников защищает ткани, в которых они синтезируются (например, ткань поджелудочной железы), от самопереваривания (такое самопереваривание наблюдается при панкреатите). Синтез новых белков, потребность в которых обусловливается патологическими факторами (например, потерей крови), может осуществляться довольно быстро. Однако для этого необходимо, чтобы имелся соответствующий и достаточно полный пул аминокислот; кроме того, процесс секреции может оказаться слишком медленным, чтобы удовлетворить внезапно возникшую физиологическую потребность в том или ином белке. Рассмотрим общие принципы превращения пробелка в зрелую, физиологически активную форму.
1. Процесс включает избирательный протеолиз, в некоторых случаях он сводится к осуществлению единственного протеолитического разрыва. 2. Полипептидные продукты могут далее функционировать как индивидуальные молекулы или же могут оставаться ассоциированными друг с другом в зрелой форме белка. 3. Процесс может (но необязательно) сопровождаться значительными изменениями молекулярной массы. 4. Главным следствием избирательного протеолиза является изменение конформации молекулы. 5. Если пробелок превращается в фермент, то указанные выше конформационные изменения играют важную роль в формировании каталитического центра фермента. В этом смысле избирательный протеолиз профермента можно рассматривать как процесс запуска конформационных изменений, обеспечивающих формирование каталитического центра.
Обратите внимание, что остатки Н1в57 и Авр 102 находятся в составе В-пептида а-химотрипсина, тогда как Бег 195 — в С-пептиде (рис. 9.6). Таким образом, избирательный протеолиз прохимотрипсина (химотрипсинотена) обеспечивае~ сближение трех остатков„участвующих в переносе заряда. Этот пример наглядно показывает, как с помощью избирательного протеолиза может формироваться каталитический центр.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
