Biokhimia_T2_Strayer_L_1984 (1123303), страница 21
Текст из файла (страница 21)
14.9): 1-й луикел — это )ь(А)3Н-Π— релуктазный комплекс; 2-й лук клс — ОН 3-цитохром-с — редуктазный комплекс; 3-й л)нкга — цитохром-с — оксидазный комплекс. Про~онный градиент, генерируемый в каждом из пунктов при переносе пары электронов от )к)А)3Н, используется для синтеза одной молекулы АТР.
Для идентификации этих пунктов применялись различные экспериментальные подходы. 1. Сравнение выхода АТР при окислении нескольких субсисраснав. Окисление ХА)3Н дает три АТР, тогда как окисление сукцината дает два АТР. Электроны от ЕА)3Н3 поступают в цепь переноса электронов на уровне кофермента О, который находится на более низком энергетическом уровне, чем 1-й пункт фосфорилирования. При окислении нефизнологического субстрата аскорбата образуется только одна молекула АТР, потому что электроны аскорбата поступают на цнтохром с, находящийся на более низком энергетическом уровне, чем 2-й пункт фосфорилнрования.
Окислительное фосфорилированне часто характеризуют отношением Р;Π— число молей неорганического фосфата, включающегося в органическую форму, в расчете на один атом потребляемого кислорода. Отношения Р: О для окисления ЫАРН, сукцината н аскорбата составляют соответственно 3, 2 и 1. 2. Термадинимическив измерения. Значение Лбы для переноса электронов от ХАРН на находящийся на более низком энергетическом уровне Ре-Б-центр в )ь)АРН-Π— редуктазе составляет — 12 ккалумольп для переноса электронов от цитохрома Ь к с, в ЯНз-цитохром-г — редукгазе . 1О ккал/моль и от цитохрома а к Оз в цнтохром-г — оксидазе — 24 ккал7моль.
Эти окислигельно-восстановительные реакции являются в достаточной степени экзергоническими для запуска синтеза АТР при стандартных условиях (Лбь' = — 7,3 ккал7моль). Значения схбь' для других реакций переноса электронов, опосредуемых кофермснтом 11 и цитохромом с, слишком малы для поддержания синтеза АТР. 3. Специфическое ингибирование таки элвюиринав. Ротенон и амнтал специфически ингнбируют перенос электронов в ХАРИ-Я вЂ” редуктазном комплексе и таким образом предотвращают генерирование протонного гралиента в 1-м пункте (см.
рнс, 14.9). В то же время указанные ингибиторы не нарушают окисления сукцината, поскольку электроны этого субстрата поступают в цепь переноса электронов после блока кофермента О. Аитимичии А тормозит ток электронов между цитохромами Ь и с,, предотвращая синтез АТР, сопряженный с генерированием протонного срадиента во 2-м пункте. Этот блок можно обойти добавлением аскорбата, который непосредственно восстанавливает цнтохром с. Электроны затем пойдут ог цнтохрома с к О, с одновременным синтезом АТР, сопряженным с протонным градиентом в 3-м пункте. Наконец, ток электронов может быть блокирован между цитохромоксидазным комплексом и О, пол лействием СХ, Х, и СО, ь 33 Цианид и азин реагируют с ферриформой этого переносчика, тогда как оксид углерода ингибирует ферроформу. В присутствии этих ингибнторов из-за блокирования тока электронов не происходит фосфорилирования, сопряженного с генерированием протонного градиента в 3-м пункте.
Места действия этих ннгибиторов были установлены с использованием менюди иере- креста. Бриттон Чанс (Впцоп Сйапсе) предложил изящный спектроскопический метод для определения соотношения окисленной и восстановленной форм каждого переносчика. В основе метода лежит тот факт, что окисленная и восстановленная формы каждого переносчика имеют свои характерные спектры поглощения. Добавление ннгибнтора переноса электронов изменяет соотношение этих форм. Например, добавление антимицина А вызывает переход переносчиков, локализованных в электронтранспортной цепи между МАРН и цитохромом Ь, в более восстановленное состояние, а переносчиков между цитохромом с и О, — в более окисленное состояние. Отсюда можно заключить, что антимицин А подавляет превращение цитохрома Ь в цитохром с,, потому что этот этап является пунктам перекрести.
4. Синтез системы иузырькав, садержаигих лишь один пункт выброса протопит Каждый из трех участков выброса прогонов был воспроизведен в синтетических фосфолипидных пузырьках, содержащих АТРазу. Добавление к таким пузырькам окисляемого субстрата приводит к генерированию протонодвижущей силы, достаточной лля синт.еза одной молекулы АТР на пару электронов. 14,7, Протоны выгалквваются асимметрично приентированнымн траисмембранными комплексами Генерирование протонного градиента при потоке электронов через три участка дыхательной цепи, в которых происходит запасанис энергии, требует их асимметричной ориентации. Кроме того, три соответствующих ферментных комплекса должны располагаться на мембране таким образом, чтобы протоны могли перекачиваться со стороны матрикса на цнгоплазматическую сторону.
Изучению этих важных аспектов 14. Окислвтельиие фвсфприднрввание 81 таблица !45 Компоненты мнгохонлрнальнон пенн переноса зчктронов. )Ре Ргеггеэ.и'., Егвьыг1, Апп. Нет. В!осйею., 46, 2!5 (19778 Локализация связывающих участков" Масса, кда !1ростетическа» Ферментный «омпяекс группа М-сгорона УС Ц-сг арона ГМЫ Ге-5 РАР Ге-5 Гем Ь Гем с, Ее-5 Гем с 850 ЫАРН НАРН-СГ-ревуктаза Сукцинат.()-релуктаза Сукпиназ ('.! Циточроьг с гбО Янг-цитохром с Цизохром с, Цизохром о Циготром г Циточром г Ог Ге.м е Гем и, Са Цигохром-с — оксилаза " Все «омпоисигы — интегральные мембранные белки, ро г тохр, р л в. ге бо яолорасг оримый периферический мембранный белок, и кофермегаа (), козорый явяяюся лнпгглорасзворимым хиноиом.
М- стропа- поверкиость, обрашенная ь матрнксу. У(' — углеволоролная серелина н Ц-сторона †поверхнос внутренней митохонлриаяьной мембраны, обрашениая к цитоплазмс. Часть 1!. Генерирование н хранение энергии 82 цепи переноса электронов в большой мере способствовало использование субмитохондриальных частиц, образующихся при озвучивании митохондрий (рис. 14.10). Наружная поверхность субмитохондрнальных частиц соответствует обращенной к матриксу поверхности внутренней мембраны интактной митохондрии.
Таким образом, обе поверхности внутренней митохондриальной мембраны †обрашенн к цитоплазме поверхность в интактной митохондрии и обрашенная к матриксу поверхность субмнтохондрнальных частиц †доступ экспериментальному исследованию. Расположение белковых компонентов дыхательной цепи в этих препаратах изучали, используя протеолитические ферменты, спепифическне антитела, лектины и не проникающие через мембраны меченые реагенты. Например, субъединицы И, )Гн (Г) цитохромоксидазы могут быть помечены только со стороны матрикса. Цитохромоксидаза связывает цитохром с исключительно на цитоплазматической поверхности и перекачивает протоны только в одном направлении.
Эти эксперименты и аналогичные исследования, проведенные с МАРН-()- редуктазой и ОНл-цитохром-с — редуктазой )табл. 14.2), показали, что все тро заиасагои(ое энергию системы пронизывают насквозь ви>треииую .читахаидроальную мембрану и ориентированы игимлгетричиа. Откуда берутся транслоцируемые протоны? Одна из возможностей состоит в том, что это -протоны, которые непосредственна участвуют в химических реакциях, казализируемых указанными тремя системами. Например, когда )ч)АРН передает два электрона на )(ГАРН-9- релуктазный комплекс, в этот пропесс включаются два Н вЂ” олин от самого )(ГАРН и второй из растворителя.
Согласно другому предположению, транслоцируемые протоны могут возникать иепрлмыч нутелг, ири канфарчаг(ионных взаи.модействиях между каталитическим и белоксвязываюшим центрами в различных участках ферментного комплекса. Стехиометрия реакций переноса электронов говорит о том, что только олин протон в расчете на электрон илн два протона на каждый запасающий энергию участок (пункт фосфорилирования) могут быть «перекачаны» посрелством прямого механизма. В то же время отношение Н',!участок, запасающий энергию, находится, как оказалось, в интервале от 3 до 4, что не согласуется с прямым механизмом процесса.
Представляется ве- Рис. 14ЛО. Электронные микрофоэ.аграфии. г( - субмнтохондриальная частица с выступами Г, иа ее поверхнос<н; Б †.субмитохондриальная частица, обрабоэанная мочевипой, удаля<ошей выступы Г,: Б — изолированные Г, н Г-реконструированная субмитохоидриальная частица, образованная путем добавления Г, (фактора сопряжения) к «ободранным» мембранам. Частииа, показанная па рис.
Б, может переносить электроны па Оэ, но неспособна к образованию АТР. Реконструированная частица, показанная на рис. Г, осуществляет окислительнос фосфорнлирование. (Печатается с любезного разрешения л-ра Е(гаип Касйег.) роятным, что перенос электронов через кансдый эипш а<ощий энергию участок вьпывиет перез<ел<ангщие<э< конформации<и<в<с иэ.пене«ил, которые <э<особ<'тат<от переходу протонов иэ .читрик< ной стороны на цип<оллаэмшлическую сторону .че,ибралы. Напомним, что протоны, участвующие в 'эффекте Бора в гемоглобинс, поступают нз 14. Окнслительнве фосфорвлирование 83 участка молекулы, отдаленно<о от группы <ема (разд.
4.16). 14.8. АТР синтезируегся прн обратном токе протонов в матрице через протонные каналы Обратимся теперь к использованию протонного градиента для синтеза АТР. Фермент, катализирующий этот процесс, выявляется на эдсктронных микрофотографиях субмн<охондриальпых частиц в виде сферических выступов на поверхности (рис. 14.10). В нпгактных ми<охондрнях <акне выступы находятся на <ой стороне внугренней мигохондриальной мембраны. которая обращена к матриксу.
В 1960 г. Эфраим Рэкср (Рбга!гп Бас)<ег) обнаружил. что э<и округлые выступы (диаметром 85 А) можно улалить механическим встряхиванием. «Ободранные» субмигохондриальныс час< ипы сохраняют способность к переносу электронов по своей цепи переноса электронов, но синтеза АТР прн этом более не происходит. Отделившиеся же выступы диаметром 85 А катализируют гидролиз АТР. Но самым интересным в наблюдениях Рэкера оказался следующий факт: добавление таких АТРазных выступов к «ободранным» субмитохопдриальным частицам восстанавливало их способность синтезировать АТР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
