Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 45
Текст из файла (страница 45)
!. Все три фермента секретнруются поджелудочной железой в виде проферментов и активируются путем расшепления одной- единственной пептидной связи. Возникаю)цая при этом конпевая аминогруппа загибается внутрь молекулы и электростатнческн связывается с карбоксилат-ионом аспартата-194. 2. Последовательность расположения около 40% аминокислот в этих трех ферментах идентична. Для аминокислотных остатков, локализованных во внутренней части молекулы, степень идентичности еше выше. 3.
Фторофосфаты, в частности ДИФФ, нгнибируют все три фермента. Подобно химотрипсину, и трипсин, и эластаза содержат в активном центре остаток серина. Более того, во всех трех ферментах одинакова после- довательность амююкислот, окружающих серии: С!у-Авр-Бег-О!у-О1у-рго.
4. При рентгеноструктурном анализе было выявлено большое сходство третнчной структуры этих трех ферментов (рис. 8.21). В эластазе и трнпсине, как и в химотрипсине, имеется система переноса заряда, а также полость оксианиона. 5. Механизм каталитического действия всех трех ферментов почти одинаков. Их эффективность в качестве катализаторов обеспечивается тем, что они стабилизируют переходное состояние реакции.
Полость оксианнона и система переноса заряда — это те существенно важные структурные элементы каждого из ферментов, которые способствуют образованию тетраэдрического промежуточного соединения. Будучи сходными по структуре и механизму действия, эти ферменты поразительным образом различаются по специфичности. Субстрат химотрипсина должен иметь ароматическую нли большую неполярную боковую цепь. Для трнпсина требуется субстрат, содержащий лизин или аргинин. Ни один из этих субстратов не пригоден для эластазы, проявляющей специфичность в отношении неболыпих незарюкенных боковых цепей. Как показал рентгеноструктурный анализ, эта разница в специфичности рассматриваемых ферментов обусловлена очень небольшими структурными различнямн участков связывания субстрата (рнс.
8.22). В химотрипсине ароматические 8. Активация профермеитов щие карман в химотрипсине, в эластазе заменены остатками валина и треонина, имеющими значительно большие размеры. Струк гурные изменения, происходящие при активации трипсиногена, несколько отличаются от изменений, связанных с активацией химотрипсиногена. Рентгеноструктурные исследования, проведенные независимо Робертом Хьюбером и Робертом Строудом (К. НцЬег, К.
81гонб), показали, что при активации трипснногена происходят значительные изменения конформации четырех протяженных отрезков полипептида, составляющих примерно 15, молекулы. Эти области, названные доченцчи активации, не имеют устойчивой структуры в пуафер.ченте. но приобретиют строго определенную конфорчацию в трипсине. Кроме того, полость оксианиона в трипсиногене расположена слишком далеко от гистн. лина-57 и поэтому не может способствоватг образованию тетраздрического промежу. точного соединения. Авр-1 О Яем!95 О!у-1 93 Рис.
8.20. Окружение аспартата-194 и нзолейцина-16 в химотрипсине. Электростатическое взаимодействие между карбоксилат-ионом Авр-194 (красный) и и-)х(Нз-группой 1!е-16 (синяя) играет важную роль в каталитической активности химотрипсина. Эти группы расположены в непосредственной близости к системс переноса заряда.
1В!озв П.М., 81е!1х Т; А., Х-гау б!((гас!!оп вгцб!ев о( епхуппз, Апп. Кем Вюсйегп., 30, 86 (1970).~ н большие неполярные боковые цепи субстрата размещаются в неполярном кармане. В трипсине имеется такой же карман, отличающийся, однако, от неполярного кармана химотрипсина заменой одного остатка— вместо серина стоит аспартат. Этот аспартат в неполярном кармане трипсина образует прочную электростатическую связь с положительно зарюкенными боковыми цепями лизина или аргинина субстрата. В эластазе же нет такого кармана для субстрата, поскольку два остатка глицина, выстилаю- Часть 1 162 Конфврмацвя н динамика 8.12.
Ингнбитор панкреатического трнпсина прочно связывается в активном центре тряпкина Регуляция активности панкреатических протеиназ осуществляется двумя различными путями. Первый — превращение профермента в активную протеиназу путем расщепления одной пептидной связи. Это очень точный механизм ивключенияп ферментативной активности, однако он необратим„н, следовательно, для остановки протеолиза должен существовать второй регуляторный механизм.
Эту функцию выполняют специфические ингибиторы протеиназ. Например, панкреатический инеибитор трипсина, белок массой 6 кДа, ингибирует активность трипсина, очень прочно связываясь с его активным центром (рис. 8.23). Константа диссоциацин комплекса составляет 1О 'з М, что соответствует стандартной свободной энергии связывания примерно — 18 кДа!моль, Примечательная особенность этого взаимодействия состоит в том, что комплекс не диссоциирует ни в 8 М растворе мочевины, ни в 6 М гаунидингндрохлориде, Между тем этн денатурирующие агенты практически всегда вызывают днссоциацию олигомеров белка на составляющие субъединицы. Такая удивительная стабильность рассматриваемого комплекса объясняется тем, что ингнбитор трипсина является очень эффективным аналогом субстрата.
Рентгеноструктурный анализ показал, что 4 Химотрипенн Рнс. 8.21. Сравнение конформации основной цепи химотрипсина (А) и эластазы (Б). Локализация системы переноса заряла (остатки 102, 57 и 195) и и-аминогруппы остатка 16 выделена цветом, чтобы подчеркнуть сходство структуры этих ферментов. (На>т!еу В.$., Я>ог!оп О. М. 1п: Т!1е Епгушсэ, Р.Р. Воуег, ед„3гд ед., ч. 3, Асаь(егп!с Ргевв, 1971, р.
362.) Б Элвствза с крайне малой скоростью. Период полужизни комплекса трипсин — ннгибитор составляет несколько месяцев. Ингибитор обладает очень высоким средством к тринсину в силу почти идеальной комплементарности вго структуры активному центр> тринсина. Ограниченная подвижность конформации ингнбнтора в участке его связывания с ферментом блокирует процесс катализа и приводит к исключительно высокой прочности комплекса с трипсином. боковая цепь лизина-15 в молекуле ингибитора соединяется с боковой цепью аспартата в субстрат-специфичном кармане фермента.
Кроме того, между полипептидными цепями фермента и ингибитора возникает болыпое число водородных связей. Онн располагаются так же, как водородные связи между ферментом и истинным субстратом. Но что самое главное-карбонильная группа лизина-15 и окружающие ее атомы ингибитора плотно входят в полость оксианиона в ферменте. Однако весь комплекс как будто застывает на этом промежуточном этапе катализа — видимо, потому, что гистндин-57 фермента, будучи неподвижным, лишен возможности перебросить протон на амнлный азот ингибитора. Пептидная связь между лизином-!5 и аланином-16 в панкреатическом ингибиторе трипсина расщепляется, но К.
Актнвяцяж ироферментов 163 ЯЛЗ. Днвергентная н коивер~ ситная эволюция сернновых протенназ Химотрипсин, зластаза и трипснн обладают в целом сходной последовательностью аминокислотных остатков, поскольку они возннкди из общего предшественника. Ген фермента-предшественника, по-видимому, несколько раз удваивался. В результате последующих мутаций этих генов появились в конце концов современные ферменты.
Возникновение различной специфичности в ходе мутаций генов, произошедших от общего предшественника, представляет собой процесс дивергвнтной эволюции. Сравнивая химотрипсин с бактернальным ферментом субтилизином, мы сталкиваемся с эволюционным процессом другого типа. Ингнентор Суз-1б нг Сн, сн, сн, 1 Хнпотрнпснн нн+ о о- 'Ъ |' С 1 сн, Азр-1 89 Трнпснн Трнпснн Рис. 8.23 тпг На! Рис. 8.22. Эпвстозп Очень упрощенное изображение участка связывания субстрата в химотрипсине, трипсине и эластазе. Субтилизин — это также сериновая протеиназа. Однако последовательности аминокислот в химотрипснне и субтнлизине совершенно различны, что указывает на их независимое появление в процессе эволюции. Например, в молекуле химотрипсина имеется лять дисульфидных мостиков, тогда как в субтилизине -ни одного.
Последовательность аминокислот вокруг серина в активном центре субтилизина и химотрипсина имеет следующий вид: -С!у-ТЬг- Бег '-Мес-А!а-Бег в стптнлнзннз -С1у-Азр-Бег"-С1у-С)у-Рго в зннотрнпснно Совершенно различны трехмерные структуры этих ферментов. Тем более удивительным оказалось сообщение о том, что в субтилизине имеется система яереяоса заряда, состоящая, как и в химотрипсине, из Часп ! 164 Конформацая и дивазивкя Основной элемент взаимодействия панкреатнческого ингибитора трипсина с трипсином состоит в образовании электростатической связи между лизином-15 ингибитора и аспартатом-189 фермента.
Кроме того, — ХН;-группа лизина-15 соединяется водородной связью с несколькими атомами кислорода в субстрат-специфичном кармане молекулы трипсина. остатков аспарагиновой кислоты, гистидина и серина. Более того, в субтилизине имеется полость оксианиона, стабилизирующая тетраэдрическое промежуточное соединение. Сходство системы переноса заряда, полости оксианиона и механизма катализа в случае субтилизина и химотрипсина-это поразительный пример пезавигилюй, конвергентной эволюции на уровне молекул ферментов.
Почему независимые, параллельные эволюционные процессы привели к одному и тому же решению в таких разных случаях, как сериновые протеиназы поджелудочной железы позвоночных и бактериальный субтилизин? Как описывается далее (разд. 8.16), существует, по-вндимому, довольно мало способов расщепления пептидных связей. Изучение нескольких сотен протеолитических ферментов показало, что имеется, быть может, только четыре основных типа механизмов протеолнза и что сериновые протеиназы распространены наиболее широко. 8.14. Коорлинированнан активация панкреатических проферментов Расщепление белков в двенадцатиперстной кишке требует одновременного действия нескольких протеолитических ферментов, поскольку каждый из них специфичен в отношении ограниченного числа боковых цепей. Следовательно, все проферменты должны превращаться в активные ферменты в одно и то же время.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
