Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Трехмерная структура химотрипсина Понять суть этого удивительного процесса активации можно, лишь зная в деталях структуру н механизм каталитического действия химотрипсина. К счастью, фермент этот исследован дос~а~очно хорошо мего- дами химического и рентгеноструктурного анализа. По существу химотрнпснн — зто олин из самых изученных ферментов, и поэтому имеет смысл рассмотреть его более детально.
Молекула хнмотрипсина состоит из трех полипептидных цепей, соединенных двумя межцепочечнымн дисульфидными связями (рис. 8.4). Масса фермента составляет около Электронная микрофотография зимогеновых гранул в ацинарных клетках поджелудочной железы. (Печатается с любезного разрешения д-ра О. Ра!ак)е.) 8. Активация профермснтов 245 Химотрипоиногвн (неактивный) Тоипоин Т 1 15 16 245 к-Химотрипоин (активный) Агп Пе имотрипоин зег-Агр впо ТЫ -Авп 14 18 147 148 „1 13 16 146 149 245 а-Химотрипоин (активный) 'ьеи А-цепь пе Туг В.цепь А)а С.цвпь Рнс.
8.4. Рнс. 8.3. Активация хнмотрипсиногена. В молекуле а-химотрнпсина имеются два межцепочечных дисульфидных мостика и три внутрицепочечные дисульфидные связи. 25 кДа. Трехмерную структуру фермента при разрешении 2 А (рис. 8.5) установили Дэвид Блоу (Р. В!отн) н сотрудники методом рентгеноструктурной кристаллографии. Молекула химотрипсина имеет компактную эллнпсоидную форму размером 51 х 40 х 40 гч.
Все заряженные группы, за исключением трех, абсолютно необходимых для катализа, находятся на поверхности молекулы. Молекула свернута очень сложно; в отличие от миоглобина и гемоглобина она содержит очень мало а-спиралей. Полипептидные цепи в основном вытянуты и нередко идут параллельными тяжами на расстоянии друг от друга примерно 5 А. Между пептидными группами в прилегающих тяжах образуются многочисленные водородные связи. Часть молекулы обладает вторичной структурой, напоминающей антипараллельные складчатые слои, как это наблюдалось и в лизоциме. Часть 1 154 Конформации н дниамнка 5 — 6 6 — 6 ) 5 5 5 8.3.
Химотрипсин специфичен в отношении ароматических и больших ненолярных боковых цепей Биологическая роль химотрипсина- гидролнзовать белки в тонком кишечнике (рис. 8.6). Равновесие этой реакции сдвинуто почти полностью в сторону гндролиза (> 99%). Однако химотрипсин способен гидролизовать с высокой скоростью далеко не всякую пептианую связь. Он действует избирательно на пептидные связи, образованные кирбакгильными группами аминокислот с ароматическими бакавьгми цепями— тирозина, триптофана и фенилаланина, а также аминокислот с гидрофабными остатками большого размера, например метионина (рис.
8.7). Химотрипсин гндролизует также эфирные связи. Хотя эта реакция не имеет существенного физиологического значения, она представляет интерес в том отношении, что имеет много общего с пщролизом пептидной связи (рис. 8.6). По существу, значительная часть сведений о механизме каталитического действия химотрипсина была получена при изучении гидролиза простых эфиров.
8.4. Прн катализе химотрннсином часть субстрата ковалевтно связывается с ферментом Химотрнпсин каталнзирует пщролиз пептидных и эфирных связей в два отдельных Рис. 8.5. О й,— С ь» — йз + Н»О О й,— С + НН й, О Н Пантнд Клеанта явнн Клеанта Сннрт 155 Трехмерная струк гура п-химотрипснна. Показаны только ауглеродиые атомы. Цветом отмечены участвующие в катализе остатки. (В!ов» Р. М.
1п: ТЪе Епхушез, Р.Р. Воуег, е»(., Зг»1 е»1., ч. 3, Аса»(. Ргезз, 1971, р. 194) этапа. Впервые это было обнаружено при изучении кинетики гидролиза л-нитрифенилацетата. Прн использовании больших количеств фермента можно отчетливо проследить наличие двух фаз в высвобождении одного из продуктов реакции. лнитрофенола (рис. 8.8). Сначала наблюдается бьютрое взрывообразное высвобождение л-нитрофенола, после чего он образуется уже с меньшей стационарной скоростью. На первом этапе л-нитрофенилацетат присоединяется к химотрипсину, т.е. образуется фермент.субстратный (ЕЯ) комплекс О й,— С О вЂ” й,+ НО= Рис.
8.6. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных и эфирных связей. (рис. 8.9). Эфирная связь в субстрате при этом расщепляется. Один из продуктов реакции — л-нитрофеиол — высвобождае»си, тогда как ацетильная группа субстрата становится ковалентносвязанной с ферментом. Далее вода атакует ацетил-ферментный комплекс с образованием ацетат-иона и регенерированного фермента (рнс. 8.10).
Начальная быстрая фаза высвобождения л-нитрофенола соответствует этапу образования ацетил-ферментного комплекса, Этот этап называется ацилированиел». Более медленное стационарное образование л-нитрофенола соответствует этапу гидролиза ацетил-ферментного комплекса и регенерации свободного фермента.
Этот второй этап, называемый деацилированием, лимитирует скорость всего процесса гидролиза эфиров химотрипсином. Более того, ацетил-ферментный комплекс настолько стабилен, что при благоприятных условиях его удается выделить. Механизм катализа химотрипси- О й,— С +НΠ— й +Н+ О 8. Активации ирофермевтов Рис. 8.8.
О Феомент) + С вЂ” СН О вЂ » ~аеснент~ С вЂ” СН О + ОН НО» НОг и-Нмтрофанмл ацетат Рис. 8.9. Ф»рнс т + Н»О 1:: ) ! С вЂ” СН О Плееммттенниа лрелтят ецетмл- фермент Н СН СН 5 ! СНз Лцетат Рнс. 8.10. Деацилирование: гидролиз промежуточно образующегося комплекса ацетил — фермент. ние ацильной группы к ферменту, удалось опрелелить, когла был вылелен в чистом виде промежуточный продукт Š— Рм стабильный при рН 3, Оказалось, что ацильная группа присоединяется к атому кислорода специфического остатка серина, а именно серина-195. Зтот остаток серина проявляет необычно высокую реакционную способность.
Его можно специфически пометить каким-либо органическим фтарфасфатам. Рис. 8.7. ном можно представить в виде слелующей схемы: Е + В = ЕЯ вЂ” ~-» Š— Рз -~-» Е Р» 2 тле Р, -аминный (или спиртовой) компонент субстрата, Š— Рт — промежуточный продукт, образованный в результате ковалентного связывания, Рт — кислотный компонент субстрата. Особенность этого механизма реакции состоит в образовании промежуточного продукта путем ковалентного связывания; в рассмотренном выше случае происходило ковалентное соединение ацетильной группы с ферментом. В общем случае группа, присоединенная к химотрипсину на стадии Е- Р,, †э всегда ацильная группа. Таким образом, Е, — Р представляет собой промежуточное соединение ацил †ферме. 8.5. Ацильная группа соеднняетсн с необы- чайно реакционноспособным остатком серниа иа ферменте Место, в котором происходит присоедине- ОН Оепмлаланмн тмроемн трмптофап Метмонмп Химотрипсин гидролизует предпочтительно пептцдные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот, а также аминокислот с большой неполярной боковой цепью.
Часть 1 15б Конформации и динамика н с о о я х В е я я е о Ю о о о» Время после смемнеання, мс После смешивания химотрипсина и и-нитрофенилацетата можно наблюдать две фазы образования п-нитрофенола. Промежуточнма п.Нптропроатнт ацетмл — фенол фермент Ацилирование: образование комплекса ацетил †ферме в качестве промежуточного продукта. Π— » (Ферме~.~ Ч С вЂ” СН + — — з О ~ Фермент СН ОН Н Н С вЂ” С вЂ” СН з з ΠŠ— р О ) О Н С вЂ” С вЂ” СН з з Н Димтопропипфторфоофет !дИФФ1 н Н С вЂ” С вЂ” СН з ~Фермонт1 СН,О -Р=О + НЕ О нс — с — сн з з н Инеятмемроеемные феЗзмеит Рис.
8.11. Диизопропилфторфосфат (ДИФФ) инактивирует химотрипсин ну~ем образования диизопропилфосфорильного производного серина-!95. например диизопропилфторфосфатом (ДИФФ), который взаимодействует только с серином-195, давая неактивный высокостабильный комплекс диизопропилфосфорил— фермент (рис. 8.11).
О повышенной реакционной способности серина-!95 отчетливо свидетельствует тот факт, что остальные 27 остатков серина в химотрипсине не взаимодействуют с ДИФФ. О )( ~Фермент~ — СНз — Π— С вЂ” СНз Серии дцетмльмея 195 труппе Химотрипсин — не единственный фермент, инактивирующийся в присутствии ДИФФ. Множество других пратеолитических ферментов, например трипсин, эластаза, тромбин, субтилизин, специфически реагируют с ДИФФ, полностью теряя при этом активность. Как и в случае химотрипсина, реакция этих ферментов с ДИФФ идет только по одному остатку серина. Отсюда и их общее название — сериповые протеиназы.
ДИФФ вступает также в реакцию с остатком серина в ацвтилхолцнэстеразе — ферменте, играющем ключевую роль в перслаче нервных импульсов в определенных синапсах. Как уже упоминалось в гл. 6, способность ДИФФ инактивировать ацетилхолинэстеразу лежит в основе его использования в инсвктнцидах и нервно-пара.штических газах. 8.6. Участие гнстидина-57 в катализе выявляется с помощью аффинной метки Участие в катализе второго аминокислотного остатка было установлено путем исполь- Группа. опродопяющея специфичность Н О 1 )! СН вЂ” С вЂ” С вЂ” СН С! н — н Реакционно- И способная группа Структура тозил-1.-фенилаланинхлорметилкетона (ТФХК), используемого в качестве аффинной метки химотрипсина (К'-тозильная группа).
Рис. 8.12. 157 8. Акзивщкя профермеитов зования так называемой аффинной метки, или метки но сроДству. Метод заключается в том, что к химотрипсину добавляют вещество, которое 1) специфически связывается в активном центре в силу подобия с субстратом и затем 2) образует стабильную ковалентную связь с некоторой группой, расположенной на ферменте поблизости. Таким веществом является тозил-Ь-фенилаланинхлорметнлкетон (ТФХК), строение которого показано на рис. 8.12. Наличие боковой цепи фенилаланина в ТФХК обеспечивает его специфическое связывание с химотрипсином.
Реактивная группа ТФХК вЂ” это хлорметилкетон. ТФХК атакует химотрипсин только по гистилину-57, алкилируя один из атомов азота гистидинового кольца (рис. 8.13). ТФХК- производное химотрипсина лишено ферментативной активности. Имеется три довода в пользу присутствия гистидина-57 в активном центре фермента. Во-первых, аффинная метка в высокой степени стереоспецифична: О-изомер ТФХК абсолютно неэффективен. Во-вторых. присутствие конкурентного ингибитора трипсина — !)-фенилпропионата — тормозит реакцию с ТФХК. В-третьих, скорость инак гивацин химотрнпсина при добавлении ТФХК находится примерно в такой же зависимости от рН, как скорость катализа. 8.7. Система переноса заряда обеспечивает челночную передачу протона прн катализе Каталитическая активность химотрипсина определяется необычайно высокой реакционноспособностью сернна-195.
В физиологических условиях — — СН ОН-группа обычно инертна. Почему же в акз ианом центре хнмотрнпсина ее реакционная способность столь резко возрастает? Объяснить это можно, исходя из результатов рентгеноструктурного исследования трехмерной структуры фермента. Как и можно было предположить еще на основе результатов введения аффннной метки, гистидин-57 расположен в непосредственной близости от серина-195. Рядом находится также карбоксильная группа боковой цепи аспартата-102 (рис. 8.14). По существу каталитнческая способность химотрипснна обусловлена взаимодействием этих трех остатков. Аспартат-102 образует водородную связь с гистнднном-57, который в свою очередь соединен водородной связью с сернном-195.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
