Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Следовательно, единственным возможным местом расщенления субстрата является связь 0 — Е (рис. 7.11). 3. Какая группа на ферменте непосредственно осуществляет катализр Заключение о том, что гндролиз субстрата происходит по связи 17 — Е,позволило перейти да- Таблииа 7,1 Эффективиость олигоиеров Х-аиетвлглю- козанвив в качестве субстратов участки ееязыеанил 1 МА6 — 1чА6 — 1чд6 — ИА6 — МА6 — УчА6 1чАМ вЂ” ИА6 — ЫАМ вЂ” МА6 — МАМ вЂ” ИА6 УчА6 — ГчА6 — ГчА6 — ГтА6 — 1тА6 — МА6 1 Единственно возможное песта гидролиза группы, способные к образованию водородных связей в качестве доноров или акиепторов водорода. Отрыв или присоединение иона водорода-это критический этап большинства ферментативиых реакций. В лизоциме единственные остатки, способные быть каталитическими и расположенныс вблизи расщепляемой гликозндной связи;это аспартат-52 и глутамат-55.
Остаток аспарагиновой кислоты лежит по одну сторону от гликозидной связи, а остаток глутаминовой — по другую. Окружение этих двух кислотных боковых цепей совершенно различно, Аспартат-52 находится в полярном окружении, где он служит акцептором водорода в сложной сети водородных связей. Глутамат-35, напротив, расположен в неполярной области.
Отсюда следует, что при Рис. 7.11. Рас. 7.12. 7. Механизм действия ферментов Ход рассуждений, доказывающих, что место приложения действия фермента — глнкозидная связь между углеводными остатками О и Е. лес к выявлению тех групп на ферменте, которые непосредственно осуществляют реакцию гидролиза. Для этого, однако, нужно еще более точно локализовать место расщепления субстрата, а именно выяснить, по какую сторону от гликозидного атома кислорода происходит разрыв связи.
Ответ на этот вопрос был получен в опытах по ферментативному гидролизу в среде, содержащей воду, меченную стабильным тяжелым атомом кислорода "О (рис. 7.12). В выделенных по окончании гидролиза сахарах 'зО оказался присоединенным к С-1 остатка Гг, тогда как гидроксильная группа при С-4 в остатке Е содержала обычный изотоп кислорода. Отсюда следует, что лри гидролизе разрыв связи происходит между С-1 остатка 0 и кислородом гликозидной связи, примыкающим к остатку Е.
Эта работа может служить примером использования изотопов в изучении механизма ферментатнвного катализа. Без изотопов было бы крайне трудно, а может быть, и невозможно в данном случае установить точное место приложения действия фермента. Затем перешли к поиску возможных каталитических групп, которые должны располагаться вблизи расщепляемой гликозидной связи.
Как указывалось в предыдущей главе, под каталитическими группами подразумевают те группы фермента, которые непосредственно участвуют в образовании или разрыве ковалентных связей. Наиболее подходящие кандидаты на эту роль-это Исключается, поскольку три.ЫАП не гидролизуется Исключается, поскольку ЫАМ слиакои велик Аля участка С О С, + С Е ' — -0 Проведение гидролиза в меченной МО воде показало, что лизоцим расщепляет связь между С-1 и О, но не связь между С 1 и О(изображен только скелет остатков О и Е).
Рис. 7.13. Структура части активного цен гра лнэоцима. Желтым показаны кольца (3 и Е субсг рата кекса-ЫАО. Вблизи субстрата расположены боковыс цепи аспартата-52 (красное) и глутамата-35 (зеленое), ("(л(рзсошЬ %. Ь(., Ргос. ВоЬег( А, %с)сЬ Роипд. Соп(. СЬегп. кез, 15, 150 (1971.)3 рН 5, оптимальном рН для гидролиза лизоцимом хитина, оснирогиновоя кислота е положении 52 должна находиться е ионизировинной СОО -форме, тогда кок глути.минович кис.юта л положении 35 — в неионизировонной СООВ-форме.
Расстояние между гликозилной связью и ближайшим к пей аз омом кислорода как одной, так и другой кислотной группы составляет примерно 3 А (рис. 7.13) 7.6. Промежуточное образование нона карбония-критический эз.ап катализа На основе изложенных структурных данных Филлипс (РЬ)11(рз) и сотрудники детально разработали вероятный механизм каталитического действия лизоцима. В каталитическом цикле они выделили следующие важные этапы. 1.
— -СООН-группа остатка 35 передает Н' на связь между С-1 кольца О и гликозидным атомом кислорода; в результате данная связь расщепляется (рис. 744). 2. Это создает положительный заряд на С-1 кольца О. Образовавшийся короткожи- Часп 1 140 Конформации и динамика вущий продукт называется ионом коубонич. поскольку он содержит положительно заряженный атом углерода.
3. Димер )чАО, состоящий из остатков Е и Р, отдаляется ог фермен тов в результате диффузии. 4. Образовавшийся в качестве промежуточного продукта нон карбония реагирует с ОН -группой растворителя (рис. 7.15), Тетра-ХАО, состоягций нз остатков А, В, С н (3, отлаляется от фермента путем диффузии. 5.
Глутамат-35 вновь протонируется, и фермент може~ вступать в новый каталитический цикл. Основные элементы этой схемы катализа следующие. !. Обгиий кислотный катализ. Источник протона — глутамат-35, который находится в ненонизированной форме и отстоит от гликозидного атома кислорода на оптимальное расстояние — 3 А. 2, Образовш<ие в кичестве пролгежуточного продукта иона карбония. Два разных по своей природе фактора, оказывающих стабилизирующий эффект на ион карбоння, значительно облегчают осуществление ферментативной реакции.
К ним относятся: а. Электростатический фактор, т.е. присутствие отрицательно заряженной группы поблизости (в 3 А) от образующегося в качесгве промежуточного продукта иона карбония. Аспартат-52, находящийся в форме отрицательно заряженного карбоксилат-иона, электростатически взаимолействует с положительным зарядом на С-1 кольца (3. б. Геометрический фактор, а именно деформация кольца (3 (рис. 7.16). Гекса-Ь)АО размещается наилучшим образом в щели активного центра фермента при условии, о 0- о — н о' 61ц Зб Рис.
7Л4. Рнс. 7.15. 141 Первый этап постулированного механизма действия лизоцима перенос Н" от О1и 35 на атом кислорода гликозидной связи. При этом происходит расщепление гликозидной связи и образование иона карбония. что геометрия кольца 13 меняется от конформации кресла к конформации полукресла. Такая деформация способствует ускорению катализа, так как при конформации полукрссла значизельно облезчается образование иона карбония. Расположение углеродных атомов 1, 2 и 5 и кислородного атома кольца в одной и той же плоскости при конформации полукресла приводит к тому, что положительный заряд распределяется между С-1 и атомом кислорода кольца.
Таким образом, связывая субстрат, фермент Реакция гидролиза завершается присоединением ОН к промежуточно образовавшемуся иону карбония и Н + к боковой цепи О1п 35. заставляет его принимать форму переходного состояния, а именно форму иона карбония. 7.7. Экспериментальное доказательство предложенного механизма ферментативного катализа Основанная на рентгеноструктурных данных гипотеза о характере связывания субстрата и механизме катализа была проверена постановкой многочисленных химических экспериментов. Вес полученные результаты поптверждают правильность выдвинутой гипотезы.
Приведем ряд наиболее существенных экспериментальных доказательств. 1. Способ расизепвения субстрата. В соответствии с прелположением о том, что расщепление гексамера происходит между 4-м и 5-м остатками, оказалось, что действительно секса-г1АО расщепляется на тетра- П-. 0 н Зб С, 'У о О 7. Механизм денствня ферментов с-з с-г Кислород Рис. 7.16. ИАО, МАО, МАО» Рис.
7.17. Изменение конформации кольца Р субстрата лизоцима в конформацию полукресла. А — углеводный остаток в обычной конформации кресла; Б — при связывании с лизоцимом атом кислорода кольца и С-5 в углеводном остатке Р перемещаются так, что С-1, С-2, С-5 и О оказываются в одной плоскости, как это показанона рпс. В. (РРВ!1!рз Р.С., ТЬе 1Ьгее-дппепз!опа! з!гнсзпге о( ап епхузпе шо!есн1е, Сорупяйг 1966 Ьу бс!епббс Ашепсап, 1пс.) ХАО и ди-ХАЙ (рис. 7.17). 2. Сродство связывания. Путем измерения равновесия при реакции связывания с ферментом каждого из шести сахаров определяли их вклад в общую величину свободной энергии связей, представленных в гексамере(рис. 7.18).
Обнаружилось поразительное явление: вклад углеводного остатка Р был отрицательным. На связывание остатка Р расходовалось около 4 ккал/моль. Этот результат подтверждает гипотезу о деформации остатка Р при связывании с ферментом: изменение от конформации кресла к конформации полукресла требует энергии. Любопытно также, что остаток С вносит наибольший положительный вклад в сродство связывания. Действительно, рентгеноструктурные данные показывают, что остаток С образует большое число водородных связей и вандерваальсовых взаимодействий. 3. Аналоги переходного состояния. Представление о деформации углеводного остатка Р в конформацию полукресла — ва:кный аспект постулированного механизма катализа, поскольку конформация полукресла Часть 1 142 Кеифармации и динамика Б в характерна для переходного состояния.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
