Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Примем, что в ходе определения концентрация пенициллина практически не менялась. '!Пенициллин), М Количество гилроливовавогегос» пенициллина, моль а) Постройте по этим данным график в координатах 1!У против 1![Б]. Подчиняется лн пен!щиллиназа кинетике Михаэ- Часп 1 130 Коиформация и динамика лиса — Ментен? Если да, то чему равна Км? б) Чему равна У,„? в) Каково число оборотов пенициллиназы в этих экспериментальных условиях? Примем, что на одну молекулу фермента приходится один активный центр. 3.
Измеряли кинетику ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата в присутствии или в отсутствие ингибитора (1); были получены следующие данные: Скорость реакции, мкмоль/мин бев ингибитора с ннгибито- ром а) Чему равны У,„и К„в отсутствие ингибитора? В присутствии его? б) Каков тип ингибирования? в) Чему равна константа связывания ингибитора? г) Если [Я=1.10 5 М и [Ц=2.10 3 М, то какова доля молекул фермента, связавших субстрат".
Связавших ингибнтор? д) Если [э1= 3.10 ' М, то какова доля молекул фермента, связавших субстрат в присутствии 2 10 М ингибитора н в отсутствие его? Сравните соотношение полученных величин с соотношением скоростей реакции при тех же условиях. 4. Анализировали кинетику фермента, рассмотренного в задаче 3, в присутствии другого ннгибитора, добавленного в концентрации 10 ' М: 13), М Скорость реакции, мкмоль/мин бев ингибитора с ингибито- а) Каковы значения 1'.„и Км в присут- ствии ннгибитора? Сравните их с вели- чинами, полученными в задаче 3. б) Каков тип ингибирования? в) Какова константа диссоциации этого ингнбитора? г) Прн Я = 3 10 ' М какая доля молекул фермента связана с субстратом в присутствии !О 4 М ингнбитора? В отсутствие его? 5.
График в координатах 1/Р против 1/(Я называют графиком Лайнуивера-Берка. Кинетические данные можно изобразить также в координатах Р против )?[Я, т.е. в координатах Эди— Хофсти. а) Преобразуйте уравнение Михаэлиса— Ментен так, чтобы получить Р как функцию г/Я. б) Каков физический смысл наклона кривой и точек ее пересечения с осью х н осью у на графике !'против )?Я? в) Изобразите, как должна выглядеть зависимость 1'от )ЯБ! в отсутствие ингнбитора, в присутствии конкурентного ннгибитора, в присутствии неконкурентного ннгибитора? 6.
В случае аллостерических ферментов ингибнтор в низких концентрациях часто оказывает активирующее действие. Почему? (Подсказка: подумайте об аналогии с СО-гемоглобином.) 7. Гормон црогестерон содержит две кетонные группы. О свойствах рецепторного белка, узнающего прогестерон, известно очень мало. Боковые цепи каких аминокислот могли бы образовать волородные связи с прогестероном при рН 7? (Примем, что боковые цепи в белке-рецепторе имеют те же значения рК, что и в свободных аминокислотах, растворенных в воде.) 8. Допустим, что субстраты А и В конкурируют за фермент. Составьте выражение, связывающее соотношение скоростей использования А и В ()х/)в) с концентрацией этих субстратов н с величинами их )гз н К„.
(Подсказка: выразите )'„как функцию /гз/Км для субстрата А и затем сделайте то же для субстрата В.) Можно лн считать, что специфичность определяется только Км? Дополнительные вопросы см.: зч'оод ЪЧ. В., %!Ьоп э. Н„Веппоэч й.М., Ноод 1.. Е., Вюсйеппагу: А РгоЫегпз АрргоасЬ, Веп)ашш, 1974, гл. 6 и 7, а также Мопгйогпегу К„бнепзоп С.А., Опав!)гаг)че РгоЫешз ш 1)зе ВюсЬеш!са! бс!евсея, 2пд ед., Егеешап, 1976, гл. 11. ГЛАВА 7. Механизм действия ферментов: лизоцим и карбоксипептидаза В !922 г, лондонский бактериолог Александр Флемин) (А. г )еш1пй) простудился. Он был не из тех, кто упускает случай, и быстро сообразил, что может использовать свое недомогание как возможность провесзи эксперимент.
Поместив несколько капель носовой слизи на чашку, где выращивались бактерии, он через некоторое время с волнением обнаружил, что вокруг слизистых выделений бактерии растворились, Флеминг предположил, что в слизи, вероятно, содержится универсальный антибиотик, поиском которого он как раз занимался. Флеминг установил природу антибактериального вещества; это был фермент, который он назвал лнзоцимом — лито, потому что он растворял (лизировал) бактерии, цим (зи.и ), потому что он был ферментом (энзимом). Флеминг открыл, кроме того, новый вид бактерий, особенно чувствительных к действию лизоцнма; эти мелкие окру1лые бактерии он назвал М)сгосоетих !)зоЫе(кг(сих ("ое1)гг1)гоз" — способный показывать). Флеминг обнаружил, что много лизоцима содержится в слезах. Слезы получали от добровольцев, которых подвергали «испытанию лимоном» вЂ” закапывали в глаз немножко лимонного сока.
Тогда же в журнале «Яг, Маггу'з Нозрйа! Оатег)е» была помещена карикатура, изображающая детишек, пришедших ради нескольких пенсов в лабораторию Флеминга, где один сотрудник их колотит, а второй собирает слезы! Флеминг был, однако, разочарован, когда обнаружил, Часть ! )32 Конформации я динамика 7.!. Лизопнм расщепляет клеточные стенки бактерий Лизоцим растворяет клетки определенных видов бактерий, расщепляя полисахаридныи компонент клеточных стенок. Функция клеточных стенок бактерий — обеспечение механической прочности. Бактерия, лишенная клеточной стенки, обычно лопается изза высокого осмотического давления внутри клетки.
Структуру клеточных стенок бакте- Элект ронная микрофотография изолированных клеточных стенок Мгегогогсиз !)лойе(хг(- киж (Печатается с любезного разрешения д-ра гЧ. Я1агоп.) Рис. 7.1. что лизоцим не эффективен в отношении наиболее опасных микробов. Спустя 7 лет он все же открьш высокоэффективный антибиотик- пенициллин, поразительным образом подтвердив замечание Пастера, что случай является к тому, кто его ищет, сн,он дующихси остатков )т)АМ и )чАС, соединенных гликозидными связями р (1 4]. Далее, отдельные цепи полисахаридов соединяютса поперечными сшивкамн из коротких пептидов, прикрепляющихса к остаткам )ь)АМ, 7изоци.и гидролизует гликозидную связь межд! С-! А>АМ и Г-4 )тА6 (рис.
7.4). Другах гликозидная связь между С- ! )чАС и С-4 )х)АМ вЂ” при этом не расщепляется. Субстратом лизоцима служит также хитии полисахарид панциря ракообразных. Хитин состоит только из остатков )чАС, соединенных между собой гликозилными связями (3 (1 4). Н Н Н Н вЂ” Н О=С СН Н ацвтвагввжозамин (ндп! СН ОН Н Н О=С сн Н.ацвтиамурамовав киоаота (нам! Углсво>тныс остатки в полисахариде клеточных стенок бактерий. Рис. 7,2. рий мы подробно рассмотрим в одной из следующих > лав. Здесь же остановимси только на структуре их полнсахарилного компонента. Полисахарид клеточной стенки содержит лва типа сахаров: >т'-ацети,тг.никита.иин ()т) АС) и (ц-ицетит и урииовуи> кислоту ()ь(АМ).
Оба сахара являются производными !люкозвмина с ацетилированной аминогруппой (рис. 7.2). В )х)АМ углерод С-3 угле- водного кольца образует эфирную связь с боковой цепью лактата. В клеточной стенке бактерий )з)АМ и )ь(АС соединены г>шкозидной связью между С-1 одного углеводного остатка и С-4 другого. Атом кислорода в гликозидной связи располагается либо выше, либо ниже плоскости, в которой лежат углеводные кольца: при а-конфигурации атом кислорода расположен ниже плоскости сахара, при (3-конфигурации — над этой плоскостью (более подробно о свойствах и номенклатуре сахаров см. гл. 12).
Все гликозидные связи в почисахаридах клеточных стенок имеют ()-конфигура>гию (рис. 7.3). )х(АМ и )т(АС расположены поочередно. Итак„ полисахарид клеточной стенки бактерий представляет собой полимер чере- 7.2. Трехмерная структура лнзоцима Лизоцим — относительно небольшой фермент. Лизоцим, вылелепный из белка куриных яиц, где он содержится в большом количес>ве, представляет собой одну полииептндную цепь нз 129 аминокислотных остатков и массой !4,6 кДа. В молекуле лизоцима имеется четыре поперечных дисульфидных мостика, обусловливав>щих стабильность фермента, Последовательность аминокислот в лизоциме показана на рис. 7.5.
В ! 965 >. Дэвид Фнллипс ((3. РРД11цъ) с со>рудниками определили трехмерную структуру лизоцима. Так впервые была получена кар>а высокого разрешении зли белка, обладающе> о фермснтативной активностью. Молекула лизопима оказалась компактной, приближенно зллипсондной формы размерами 45 х 30 х 30 А. Как показано на рис, 7.7, укладка полнпептилной пепи носи> рггвикозиаиаа связь СН ОН сн,он Н Н>С вЂ” С вЂ” Н О=С СООН СН, ндм О=С СН, нап Рис. 7.3.
)т)АМ связана с )т(АС глнкозидной связью ))(1 4). 7. Механизм действия ферментов 133 ада сн,он ЦАМ сн,он цда сн,он МАМ сн,он н — н о=с сн, н — н о=с сн, н — н о=с сн, н— о=с сн, сн,он сн,он сн,он сн,он н н — н ! о=с сн, ЦАМ н — н ! о=с сн, Яда и — н о=с сн, цда н — н ! о=с сн, КАМ Рис. 7.4.
Лизоцим гидролизует глнко- зндную связь между ХАМ и ХАО (й — лактильиый оста- ток ХАМ). очень сложный характер. В ней содержится гораздо меньше п-спиралей, чем в миоглобине и гемоглобине. В некоторых участках полипептидная цепь имеет вытянутую конформацию. В одном из этих участков цепь делает поворот и идет в обратном направлении параллельно самой себе; при этом два параллельных тяжа соединяются водородными связями, образующимися между пептилными группами.
Такие участки «шпильки для волос» подобны упоминавшимся выше аньпипараллельным 5-складчинным слоям — регулярно повторяюшимся участкам вторичной структуры в белке шелка. Внутренняя часть молекулы лизоцима, подобно молекулам многлобина и гемоглобина, почти полностью неполярна. Очевидно, что, как и в случае большинства других белков, гидрофобные взаимодействия играют важную роль в образовании третичной структуры лизоцима. Часть 1 134 Конформация и динамика 7.3.
Поиски активного центра лизоцима Детальное воспроизведение трехмерной структуры лизоцима еще не раскрывало механизма его каталитического действия. Более того, рассматривая карту электронной плотности, трудно было определить хотя бы локализацию активного центра. В отличие от миоглобина и гемоглобина в лизоциме нет простетической группы, т. е. нет встроенного маркера активного центра. В итоге основную информацию, необходимую для идентификации активного центра, определения способа связывания субстрата и выяснения механизма ферментативного действия, удалось получить только при использовании ингнбиторов, а именно при рентгеноструктуриом анализе комплексов лизоцима с ингибиторами. Если трехмерная структура белка известна, то определить методом рентгеноструктурного анализа способ связывания с ним небольших молекул обычно уже нетрудно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
