Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Эти опыты легко выполнимы, потому что кристаллы белка очень пористы. Даже относительно большие молекулы ингнбитора способны диффундировать по каналам между молекулами белка, попадая в участки специфического связывания. Изменение электронной плотности, обусловленное встраиванием дополнительной молекулы, можно рассчитать непосредственно по интенсивности рефлексов Рнс. 7.5. Рис.
7.7. Рис, 7.6. Последовательность аминокислот в лизоциме из белка куриных яиц. Красным показаны остатки, входящие в состав активного центра. (Сапйе!б й.Е., Ещ А.К., 1. Вю!. СЬеш., 240, 2000 (1965); РЫ!!!рв Р.С., Яс!. Ашег., (5) 215, 79 (1966).] (используя данные, полученные предварительно на нативном белке) при условии, что структура кристалла не претерпела существенных изменений. Такой подход получил название разностного метода Фурье. Рентгенограмма кристалла лизоцима.
(Печатается с любезного разрешения д-ра 11. РШШрз.) 4О В идеале следовало бы использовать разностный метод Фурье для определения структуры фермент-субстратного (ЕЯ) комплекса в процессе катализа. Однако в обычных условиях превращение связанного субстрата в продукт реакции происходит значительно быстрее, чем диффузия новых молекул субстрата в кристалл. В некоторых случаях зто осложнение удается устранить Трехмерная структура лизопнма. Показаны только н-угле- родные атомы. (Печатается с любезного разрешения д-ра О. РЫШря.) 7. Механизм деиствня ферментов сн,он сн,он сн,он Н З о н — н н — н о==с сн, о-с сн, три.к ачвтааглюкаааюин (тр .ндп1 о-с сн, Рнс. 7.8.
Формула три-Х-ацеппглюкозамина (три-ХАО, нлн ХАО,) — конкурентного ннтнбнтора лизоцима. замедлением каталитического процесса, что достигается путем сильного охлаждения кристалла (например, до — 50"С). Этот экспериментальный подход получил название криизнзимолагии, Существует и другой подхол: исследуют комплекс фермента с таким аналогом субстрата, который либо совсем не подвергается никаким превращениям, либо эти превращения происходят очень медленно. Для лизоцима таким аналогом субстрата оказался тример Х-ацетилглюкозамина (три-ХАО, или ХАОз), структура которого показана на рис.
7.8. Олнгомеры Х-ацстилглюкозамина. содержащие менее 5 остатков. т идролнзуются крайне медленно или не гилролизуются совсем. Тем не менее онн связываются с активным центром фермента. Именно поэтому три-ХАО является мощным конкурентным ингибитором лнзоцнма. 7.4. Способ связывания конкурентного ннгнбнтора Рентгеноструктурное исследование комплекса лизоцима с три-ХАО позволило установить локализацию активного центра и выявило, какие взаимодействия обеспечивают специфическое связывание субстрата; на этой основе была разработана гипотеза, предсказывающая детальный механизм ферментативного действия лизоцима.
Оказалостн что три-ХАО присоединяется к лизоциму в щели на его поверхности, занимая при этом примерно половину щели. Связывание происходит в результате образования водородных связей и вандерваальсовых Часть 1 136 Конформации и динамика взаимодействий. Электростатические взаимодействия отсутствуют, поскольку в три- ХАО нет ионных групп.
Водородные связи между три-ХАО и лизоцимом показаны на рис. 7.9. Карбоксильная группа аспартата-101 образует водородные связи с остатками А и В. Наиболее спепнфичсские и прочные водородные связи образуются между ферментом и остатком С ингнбитора. Здесь появляются четыре водородные связи. ХН-группа индольного кольца триптофана-62 соединяется водородной связью с кислородом при С-б. Соседний аминокнслотный остаток — триптофан-63-- аналогичным образом связывается с кислородом, стоящим при С-3. Когда три-ХАО присоединяется к ферменту, кольцо триптофана-62 перемешается на 0,75 А.
Прочные водородные связи формируются между СО- н ХН-группами ацетамидной боковой цепи остатка сахара С и ХН- н СО-группами основной цепи белка, приналлежашими соответственно 59-му и 107-му аминокислот- ному остатку. Между трн-ХАО и ферментом возникаез. большое число контпактов, обутстовленных вандерваальсовыми взаимодейс'твин.ии. Остаток сахара В вовлечен в малое количество полярных контактов с ферментом, но он тесно связан с индольным кольцом триптофана-62. Остаток А довольно слабо контактирует с ферментом. 7.5. От структуры фермента-к механнзму ферментативного действия 1. Как происходит связывание субстрата? Мы уже говорили о том, что метод рентгеноструктурного анализа не дает возможности непосредственно определить, как происходит связывание с ферментом эффективного субстрата.
Однако данные, полученные при рентгеноструктурном анализе комплекса фермент-- конкурентный ингибнтор, могут сыграть ключевую роль в решении этой Тгр 62 1 -эн он Основная — ЬО4.0 107 но- нз н — н с' Азр 101 Рис. 7.9 137 Водородные связи между три- ХАО и лизоцимом. Участвующие в образовании водородных связей химические группы субстрата показаны синим, соответствующие группы фермента — красным. проблемы.
Три-ХАО заполняет только половину щели в молекуле лизоцима. Это очень многообещающее исходное положение. Было сделано допущение, что наблюдаемое связывание три-(ь(АО как ингибитора происходит с образованием тех же связей, которые возникают и при связывании субстрата. Вполне вероятно, что для образования реакционноспособного ЕБ- комплекса требуются дополнительные остатки сахара, способные заполнить вторую половину щели.
Действительно, после присоединения три-)ь(АО в щели остается место еше для трех остатков сахара. Это обналеживало, поскольку было известно, что гексамер Х-ацетилглюкозамина (гекса- ХАО) быстро гидролизуется ферментом. При тщательном построении моделей в щели на ферменте поместились три дополнительных остатка сахара, обозначенных Р, Е и Е (рис. 7.10). Остатки Е и Г подошли прекрасно, образуя несколько прочных водородных связей и контактов, обусловленных вандерваальсовыми взаимодействиями. Однако остаток О вхолил в щель Основная цепь бй толь г и условии некоторой деформации При нормальной конформации (в виде кресла) его атомы С-6 и О-6 оказывались слишком сближенными с некоторыми группами на ферменте. 2. Какая из связей расщепляется фер.ненгпо,н? Скорость гидролиза олигомеров гчацетилглюкозамина стремительно возрастает при увеличении числа остатков сахара от 4 до 5, т.
е, от )ь(АО4 ло 14АО, (табл. 7.1). Уллинение субстрата еше на один остаток ()ь(АОь) дает лополнительное увеличение скорости расщепления; однако возрастание числа остатков сахара в субстрате до 8 уже не оказывает лействия. Эти данные согласуются с результатами рентгеноструктурного исследования, показавшими.
что именно шести остатков сахара достаточно для заполнения щели, где расположен активный центр. Какая из связей в гекса-ТчАЙ расщепляется ферментом? Исходя из того, что три)ь(АО не подвергается расщеплению, можно считать, что связь А — В (т.е. гликозилная связь между остатками А и В) — это не та связь, на которую действует фермент. Аналогично этому фермент не может расщеплять и связи  — С.
Второе и решающее доказательство того, что связь  — С не 7. Механизм действия ферментов Рис. 7.10. Отиоситсльиаа Субстрат скорость гидролиза ХАСгз ХАОз МАС4 МАС5 ХАоь МАС8 о ! 8 4 000 зо обо зо обо Способ связывания гекса-ХАО (показан желтым) с лизоцимом. Расположение угле- водных остатков А, В и С (слева) соответствует локализации три-ХАО в комплексе с лизоцимом; расположение остатков 1з„Е и Г (справа) предсказали путем модельного построения. Зеленым показаны два амннокислотных остатка, непосредственно участвующих в катализе.
расщепляется ферментом, состоит в том, что ХАМ не может встать в положение остатка С. Если ХАО отлично умещается в участке С, то ХАМ здесь не умещается изза лактильной боковой цепи. Между тем в полисахариде клеточной стенки бактерий лизоцим расщепляет связь ХАМ вЂ” ХАО. Следовательно, и связь С вЂ” (У не может подвергаться расщеплению, если действительно полисахарид клеточных стенок бактерий связывается с лизоцимом таким же образом, как и гекса-ХАО. Несоответствие ХАМ положению С исключает еще одно место гидролиза, а именно связь Š— Р. Вспомним, что полисахарид клеточной стенки-зто че- Часть 1 138 Коиформащея и динамика редующийся полимер ХАМ и ХАО; следовательно, если ХАМ не может занимать положение С, то этот остаток не может стоять и в положении Е. Из приведенных соображений вытекает, что при расщеплении ферментом гексамерного субстрата связи А — В,  — С, С вЂ” )з и Š— Г не могут разрываться.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
