Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Эти три остатка создают систему переноса заряди. Как показано в разд. 8.9, эта система играет ключевую роль в катализе благодаря способности связывать протон (рис. 8.15). Погруженный в молекулу карбоксилат-ион аспартата-! 02 поляризует имидазольную группу гистндина-57, что повышает его способность осуществлять челночную передачу протона. При этом аспартат-102 и гистиднн-57 расположены так, что во время нуклеофильной атаки субстрата кислородом они акцептируют протон гидроксильной группы серина-! 95. 8.8. В хнмотрнпснне имеется глубокий карман для связывания ароматической боковой цепи Локализация участков специфического связывания и вероятная ориентация гидролизуемой пептидной связи эффективного субстрата были выявлены в результате рентгеноструктурного анализа комплексов химотрипсина с аналогами субстрата.
Установлено, что формил-(.-триптофан связывается с химотрипсином через индоль- Часть 1 158 Конформации и дннавгнка СНг С (Ч тф (гг Сн~ С Н !( (~ — + — ~( нс сн нс сн Н Гнетнннн $7 5ег-195 ~Д l) 7 Н гз-57 Рнс. 8.14. Конформация системы переноса заряда в химотрипсине. (В!очч Р.М., 81е(гг Т.А., Х-гау Ййгасг)оп зщейез о( епгушез, Апп. Кеч. ВюсЬещ., 39, 86 (1 976).1 Н С вЂ” — Π— Яег 195 Н С=С Нг5 57 О А5Р С О 102 Н С г' н н — (~ — бег 195 нс=с О~ Нг5 57 О Азр — С вЂ” О— 102 Система переноса заряда в химотрипсние: А — фермент без субстрата; Б-прн добавлении субстрата происходит промежуточное связывание протона аспартатом-102 и гистндином-57. Рис. 8Л5. Рнс.
8.13. Алкилирование в химотрипсине ТФХК. сн С=О и гистидина-57 воздействием Осноанаа цепь 193 Нт 57 зек 195 Основная це 214 ную боковую цепь, которая хорошо соответствует по размеру карману на ферменте вблизи серина-195 (рнс. 8.16). Именно наличием этого глубокого кармана объясняется специфичность химотрипсина в отношении аминокислот с ароматической иди иной гилрофобной боковой цепью большого размера. При рентгеноструктурном анализе комплексов химотрипсина с аналогами полипептидных субстратов обнаружено большое число водородных связей между основными цепями фермента и субстрата, причем эти водородные связи располагаются так же, как в антипараллельных ()-складчатых слоях.
8.9. В процессе катализа образуется переходное тетраэдрическое промежуточное соединение Широкие рентгеноструктурные и химические исследования химотрипсина позволили прийти к определенному выводу относительно механизма его каталитического действия. По-видимому, гистидин-57 и серия-195 непосредственно участвуют в расщеплении пептидной связи субстрата.
Гидролиз этой связи начинается с того, что кислородный атом ОН-группы сернна-195 атакует карбоннльный атом углерода в гидролизуемой пептидной связи субстрата. В результате связь между а~омами углерода н кислорода в этой карбоннльной группе становится одинарной и атом кислорода приобретает отрицательный заряд. Четыре атома, связанные с углеродом карбонильной группы, располагаются в виде тетраэдра. Образование из плоской амидной группы этого тетраэдрического оромелсуточного соединения оказывается возможным только благодаря возникновению волородных связей между отридагсльно заряженным атомом кислорода гидроксильной группы (называемым оксиаяиояом) и двумя )ч)Н-группами самой полипептидной цепи (рис.
8.17). В механизме образования упомянутого промежуточного соединения важную роль играет также перенос протона от серина-195 на гистидин-57 (рис. 8.18). Перенос протона значительно облегчается благодаря присутствию системы переноса заряда. Аспартаз-102 строго ориентирует положение имидазольного кольца гистидина-57 и частично нейтрализует заряд, появляющийся нл этом кольце в момент переходного состояния. Протон, накопленный парой гистндин — аспартат, переходит далее к атому азота гндролизуе- Непопярнмй карман Схематическое изображение присоединения к химотрипсину формил-).-триптофана (аналог субстрата).
Рвс. 8.16. Зег 195 Осн. цепь,, Снг ггч 195 Н к а Рис. 8.17. Тегрвэдрическое промежуточное соединение в реакциях ацилирования и деацнлирования химотрипсина. Стабильность промежуточного соединения обеспечивают водородные связи, образованные ХН-группами основной цепи фермента. Этот участок называется полостью оксиаяиояа.
159 8. Антавацвж нроферментов мой пептидной связи, которая в результате разрывается, На этом этапе аминный компонент субстрата оказывается соединенным волородной связью с гистидином-57, а кислотный компонент — эфирной связью с серином-!95. На этом завершается стадия ацилировония гидролитической реакции. Следуюшая стадия — двацилироваяив (рис. 8.19). Аминный компонент субстрата диффундирует прочь от фермента, а на его место в активном дентре встает молекула Тетреедрнчесхое дцнн-фернент переходное состоннне !пдонежуточный продукт) Субстрат 0 ть й' — сн,— о й' о=с й — Н вЂ” Н -о, с — сн — о' й — Н вЂ” Н вот 199 — сн,— о Н й — Н вЂ” Н Н СН !Ч -СН Н Н СН НС и — С Н СНг О С НС И- С Н-.
С Н Н~х 57: СН, О чь) днв 102 С Н СН, о Ъ, С Рис. 8.18. Первый этап гидролиза пептидов химотрипсином †ацилирование. Образуется тетраэдрическое промежуточное соединение. Затем аминный компонент субстрата быстро отделяется от фермента, а фермент превращается в ацил— фермент — промежуточный продукт катализа. воды. По сути деацилирование — это процесс, обратный ацилированию, нос заменой амин- ного компонента субстрата на //гО. Сначала система переноса заряда отрывает протон от воды. Образующийся ОН -ион немедленно атакует карбонильный атом углерода ацильной группы, присоединенной к серину-195. Как и при ацилировании, формируется тетраэдрическое промежуточное соединение.
Далее гистидин-57 передает протон на атом кислорода серина-195, что приводит к высвобождению кислотного компонента субстрата. Этот компонент отделяется путем диффузии от фермента, который может вступить в новый каталитический цикл. 8ЛО. Механизм активации профермента Обратимся теперь к вопросу о том, каким образом расщепление всего одной пептидной связи в химотрипсиногене превращает его в активный фермент. Трехмерную структуру химотрипсиногема исследовал Джозеф Краут (/. Кгащ), установивший, что в про- Часть 1 160 Конформации и динамика цессе активации фермента его конформация притерпевает ряд изменений.
1. Гидролиз пептидной связи между аргинином-15 и изолейцином-16 создает новые С- и )ч)-концевые группы. 2. Вновь образованная /чконцевая группа изолейцина-/6 загибается внутрь и взаимодействует г агпиртато.и-/94 внутри молекулы химотрипсина (рис. 8.20).
Протонирование этой аминогруппы стабилизирует активную форму химотрипсина, о чем свидетельствует характер зависимости ферментативной активности от рН. 3. Это электростатическое взаимодействие между положительно заряженной аминогруппой и отрицательно заряженным карбоксилат-ионом, происходящее в неполярной области фермента, запускает рял конформационных сдвигов. Метионин-192 из глубины молекулы перемещается ближе к поверхности,а остатки 187 и !93 становятся более вытянутыми. В результате образуется субстрат-специфичный участок лля ароматических и больших неполярных групп. Одну сторону этого участка составляют остатки от!89 до !92.
В проферменте эта полость для гвязывиния чисти субстрата сформирована не полностью. 4. Тетраэдрическое переходное состояние, возникающее при катализе химотрипсином, стабилизируется водородными связями между отрицательно заряженным атомом кислорола карбоксильной группы и лвумя НН-группами самой полипептидной цепи (рис. 8,17). В химотрипсиногене одна из этих ХН-групп расположена так, что недоступна для связывания.
Следовательно, в зимогене и полость оксианиона до конца не сформирована. данн -ферттент (проттектуточный продукт) о й' — сн — о-- с тетраадрнческое переходное состоннна о ц — Сн,— О дискетный конпонент суострата ц' — СН,— 0 0=-С н нс с Н сн, н сн нс н -сн нс' ы -с н Снт с Н16 Ву 0 с н сн о 1б1 11-665 О О о А р )па С с Рис, 8.19. Второй этап гидролиза пептида химотрипсином — деацилиравание. Ацил — фермент (промежуточный продукт) гнлролизуется водой.
Деацилирование по существу представляет собой реакцию, обратную ацилированию, но на место амин- ного компонента субстрата от~но~нтск Н,О. 5. Конформационные сдвиги в остальных частях молекулы очень незначительны. Таким образом, нвключение» 95ерл1ентативнай активности в белке осуществляется путем отдельных, строго локализованных канфармационных сдвигов, запускаемых гидрализам всего лишь одной пептиднай связи. 8.11. Тринсии и эластаза: вариации на тему Трипсин и эластаза сходны с химотрнпсином во многих отношениях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
