PDF (1123296), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Величина квантового выхода флуоресценции, представляющегособой отношение числа квантов флуоресценции к числу поглощенных квантов фи=n фл/nпогл, позволяет определить времяжизни возбужденного состояния молекул компонента. Скорость затухания флуоресценции позволяет судить о временисохранения энергии возбуждения в молекуле, что в сочетании со значениями квантовых выходов и скоростями тушенияфлуоресценции дает возможность проанализировать процессы растраты и миграции энергии.Флуоресценция возникает при переходе молекулы с самого нижнего колебательного подуровня первого синглетноговозбужденного состояния на основной: S1* → S0 + hv.Излучательный переход в молекуле происходит на разные колебательные подуровни основного состояния, а поглощательный– с основного почти на какой угодно возбужденный уровень.
Таким образом, энергия поглощенного кванта всегда больше,чем энергия кванта флуоресценции, а спектр флуоресценции будет расположен в более длинноволновой области, чем самыйдлинноволновый максимум в спектре поглощения (закон Стокса). Очевидно, что поскольку высвечивание квантовфлуоресценции происходит с самого нижнего колебательного подуровня возбужденного первого синглетного состояния,спектр флуоресценции не зависит от длины волны возбуждения (закон Вавилова).Длительность жизни молекулы в синглетном возбужденном состоянии обычно составляет 10-8 - 10-9 с . Интенсивностьфлуоресценции вещества можно описать следующим выражением:I = K*I0 (1-T)*фи,где I0 - интенсивность возбуждающего света, (1-T) - поглощение, а фи - квантовый выходфлуоресценции, К – коэффициент пропорциональности.Измерение спектров флуоресценции и кинетики ее изменения обычно производятся наустановке, принципиальная блок-схема которой представлена наследующем рисунке1:1.
Источник возбуждающего света. 2. Автотрансформатор. 3.Линза. 4. Светофильтр. 5. Фотозатвор. 6. Монохроматор. 7.Зеркало. 8. Фотоумножитель.9. Высоковольтный источникпитания. 10. Мотор барабана длин волн. 11. Самопишущийпотенциометр.12. Осциллограф. 13. Усилитель.
14. Кюветная камера.Малая величина квантовых выходов и низкая концентрацияфлуорецирующих компонентов приводит к тому, что интенсивность флуоресценции биологических объектов ,какправило,весьма незначительна. При комнатной температуре квантовый выход флуоресценции хлорофилла в нативныхфотосинтетических мембранах составляет не более 3%.При измерении спектров флуоресценции биологических объектов следует также учитывать влияние интенсивноговозбуждающего света на возможные индуцируемые им процессы фотохимически активных компонентов. Чтобы ослабитьвлияние возбуждения на светоиндуцируемые процессы, следует по возможности уменьшать яркость возбуждающего света наобъекте за счет улучшения условий фокусировки, а также увеличивать скорость измерений и использоватьнизкотемпературную технику.
Для решения этих задач применяют светосильные монохроматоры, чувствительные приемникисвета и охлаждение объектов вплоть до температуры жидкого азота (77К).Биологические объекты, как правило, сильно рассеиваютсвет, что приводит к усилению экранирующего эффекта (т.е. кувеличению поглощения возбуждающего света другимикомпонентами системы) и эффекта реабсорбции (поглощениясвета испускаемой флуоресценции или, так называемого,явления перепоглощения) вследствие увеличения оптическогопути. Поэтому рекомендуется, выбрав оптимальную областьвозбуждения (обычно в максимуме поглощения и, есливозможно, расположенного дальше от полосы флуоресценции,например, для хлорофилла - в синей области спектра),производить измерения в тонких слоях и при малыхконцентрациях. При этом надо стремиться уменьшитьсветорассеяние, для чего дополнительно используютсяспециальные приемы, например, инфильтрация листьеврастений, добавление глицерина к суспензии клеток,хлоропластов или хроматофоров, приготовление гомогенатов, применение специальных кювет,уменьшение светового пути вобразцах и т.д.Световая стадия фотосинтеза зеленых растений осуществляется двумя пространственно разделенными фотосистемами,которые сопряжены цепью переносчиков электронов (рис.
2).Процесс переноса электрона между обеими пигментными системами осуществляется по градиенту редокспотенциала. Доляпигментов, включенных непосредственно в фотоактивный РЦ, весьма незначительна по сравнению с общей массойсветособирающих (антенных) пигментов. Для высших растений один РЦ приходится на 400-500 молекул хлорофилласветособирающей антенны, а в состав активного комплекса РЦ входит не более 6 молекул хлорофилла а.Флуоресценция в нативных фотосинтетических мембранах продуцируется молекулами хлорофилла антенны и при комнатнойтемпературе характеризуется главным максимумом при 684-687 нм и «плечом» в более длинноволновой области около 720730 нм (для хлоропластов и гомогенатов высших растений, для клеток водорослей).
Однако в случае целых листьев растений,вследствие сильной реабсорбции в спектрах флуоресценции относительная доля длинноволновой полосы существенновозрастает.Для фотосистемы 1 квантовый выход флуоресценции при комнатной температуре в несколько раз меньше, чем дляфотосистемы-2, поэтому флуоресценция хлоропластов обусловлена в основном светособирающей массой хлорофиллавторой пигментной системы.Только при низкой температуре (77К) относительная доля (и квантовый выход) длинноволновой флуоресценции в области 730нм значительно возрастает и спектр становится более структурированным (за счет выявления дополнительныхфлуоресцирующих центров).Интенсивность флуоресценции целых клеток и хлоропластов чувствительна к температуре и ингибиторам фотосинтеза,а также претерпевает характерные индукционные изменения после «темновой» адаптации при включении света.Интенсивность флуоресценции в начальный период после включения возбуждающего света отличается от установившегосязатем стационарного уровня флуоресценции, который достигается в течение нескольких (иногда десятка) секунд.
Такаяпереходная кинетическая кривая изменения интенсивности флуоресценции обычно имеет сложный характер и отражает, такназываемую, индукцию флуоресценции. Варьируя время темновых интервалов, можно наблюдать различные индукционныекривые флуоресценции.Индукция флуоресценции интерпретируется обычно с точки зрения первичного механизма стабилизации энергиивозбуждения и переноса электрона. Флуоресценция основной массы хлорофилла (антенны) будет изменяться в зависимости отсостояния РЦ, (состояние с «закрытыми» или «открытыми» РЦ). При включении света РЦ переходит в «закрытое» состояние,когда происходит прекращение потока электронов в первичных процессах фотосинтеза.
В этих условиях поглощенная энергиясвета уже не может использоваться в фотосинтезе, поэтому и флуоресценция хлорофилла возрастает, а затем, вследствиереакции образовавшегося первичного фотопродукта Qa- с последующими акцепторами, произойдет обратный переход РЦ висходное («открытое») состояние, что приведет к замедлению скорости возрастания флуоресценции.Таким образом, по кинетике флуоресценции антенного хлорофилла измеряемой на описанной выше установкеможно следить за состоянием фотохимически активных реакционных центров внативных фотосинтетических мембранах.
Закрыть центры можно создавая также избыточную освещенность клеток, когдапроисходит световое насыщение фотосинтеза. Фотосинтетическая цепь переноса электрона как бы захлебывается от избыткапоглощенной световой энергии, переводя все большую часть поглощенной энергии света в флуоресценцию. Предполагается,что тушителем флуоресценции антенного хлорофилла является первичный хинонный акцептор (QA), локализующийся междуР680 и феофитином с одной стороны и вторичным акцептором (Qв) с другой. Было установлено, что под действием светапроисходит восстановление первичного акцептора QA до QA- и выход флуоресценции возрастает от начального уровня(Fo) до максимального уровня (Fm), т.е.
возникает так называемая переменная флуоресценция (Fv = Fm — Fo). При введениив систему избыточных количеств экзогенных акцепторов электрона (например, ферроцианида) выход флуоресценциисохраняется относительно низким. Если QA предварительно восстановлен в темноте, то при включении света сразудостигается максимальный уровень флуоресценции (Fm). Как правило, в нормальных условиях величина F0 мала, чтоговорит об активном использовании клетками энергии поглощенного света. При каких-либо воздействиях нарушаетсясостояние фотосинтетических мембран и центры (РЦ) переходят в неактивное (закрытое) состояние. Можно полностьювывести из рабочего состояния РЦ, например при действии ингибитора потока электронов диурона. В этом случаефлуоресценция сильно возрастает и приближается к своим максимальным значениям Fm.Как видно, величина Fv соответствует той части энергии света, которая используется открытыми реакционными центрами вфотосинтезе, то есть может характеризовать активность начальных стадий фотосинтеза (Рис3).Пунктирная линия отражает изменение флуоресценции в присутствии диурона (ДСМИ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
