PDF (1123296), страница 17
Текст из файла (страница 17)
На практике оценивают отношениеFv /Fm , величина которого тесно связана с первичной продуктивностью фитопланктона в природных водоемах. Она хорошокоррелирует с фотосинтетической продукцией клеток, определенной классическими методами по восстановлению СО2 спомощью радиоактивных изотопов 14 С.Широкий круг исследований, проводимых методами измерения флуоресценции хлорофилла фотосинтезирующих организмов,показал что соотношение интенсивности флуоресценции хлорофилла при насыщающем фотосинтез возбуждающем свете (Fm)и при облучении светом низкой интенсивности, не вызывающем изменений состояния фотосинтетического аппарата (F0),позволяет определить эффективность утилизации света в ходе фотосинтеза, которая равна (Fm - Fo)/Fm. Эта безразмернаяэнергетическая характеристика фотосинтеза, аналогична коэффициенту полезного действия, является универсальной и независит от видовой специфики организма.
Показано, что по флуоресценции хлорофилла, возбуждаемой источникамиимпульсного света, можно определить такие показатели долгосрочной адаптации к условиям выращивания объекта, какразмеры фотосинтетической антенны ФС2 и величину пула хинонов. В ответ на длительное (десятки минут) воздействие светаможно определить величину потока электронов по цепи фотосинтетического электронного транспорта и оценить возможностисистемы срочной защиты от избыточного облучения по нефотохимическому тушению.
Для исследования флуоресценциифитопланктона в природных водоемах на кафедре биофизики биологического факультета МГУ разработан специальныйприбор (погружной зонд-флуориметр), позволяющий проводить измерение величин F0 и Fm в водоемах на разных глубинах(до 200 м). При освещении первой слабой вспышкой света порции фитопланктона в зонде измеряется величина фоновойфлуоресценции F0 . Затем при действии второй мощной вспышки света в клетках происходит кратковременное насыщениевсех РЦ, которые не успевают утилизировать поглощенную энергию света и переходят в результате этого в закрытоесостояние.
В этих условиях флуоресценция хлорофилла возрастает до максимальных значений Fm. Таким образом можноопределить значения переменной флуоресценции Fv = Fm - F0 и отношение Fv / Fm , которые отражают эффективностьзапасания энергии света на начальных этапах фотосинтеза.Поскольку величина F0 зависит от количества хлорофилла в клетках, то это можно использовать для определения егоконцентрации. По величине F0 можно также определять и количество биомассы фитопланктона, которое пропорциональносодержанию хлорофилла в клетках. Определение величин F0 и Fv / Fm позволяет выявить ситуации, когда в водоемах имеетсямного фитопланктона (F0 велико), однако его активность и продукция невелика из-за неблагоприятных условий.
На основанииэтих данных можно получить сравнительную информацию о распределении как самого фитопланктона (F0), так и егофотосинтетической активности (Fv / Fm) по глубине и горизонтальным разрезам в водоемах и рассчитать фотосинтетическуюпродукцию.Другим источником информации о характере функционирования фотосинтетического аппарата является процесс замедленнойфлуоресценции (ЗФ), обнаруженный Арноном и Стреллером в 1951 году. Это явление состоит в том, что после световоговозбуждения в фотосинтезирующих клетках наблюдается слабое, длительно затухающее свечение, испускаемое хлорофиллом.Это свечение возникает уже после прекращения флуоресценции (F0) за счет энергии, выделяемой в ходе темновых реакцийпервичных фотопродуктов фотосинтеза в РЦ.В исследованиях первичных реакций фотосинтеза используют метод регистрации характеристик замедленнойфлуоресценции (=послесвечения).
Спектральный состав послесвечения соответствует спектральному составу света,испускаемого в процессе быстрой флуоресценции антенным хлорофиллом. Время жизни быстрой флуоресценции составляет10 в-9 – 10 в-8 с, замедленная флуоресценция может наблюдаться в течение нескольких минут после прекращенияосвещения. Быстрая флуоресценция является чисто фотофизическим процессом и обусловлена высвечиванием частипоглощенной антенным хлорофиллом энергии, которая не успела мигрировать на реакционный центр. Замедленнаяфлуоресценция тесно связана с фотохимическими реакциями, протекающими в реакционных центрах.
Основной вклад взамедленную флуоресценцию растений вносит ФС II; замедленная флуоресценция ФС I составляет не более 2% от общеговыхода послесвечения. На рис. 4 приведена схемареакций, приводящих к генерации послесвечения вреакционном центре фотосистемы IIзеленых растений, водорослей и цианобактерий.При фотовозбуждении электрон с основного уровняхлорофилла реакционного центраР680 переходит на синглетно-возбужденный уровеньР*680 (переход 1).
С уровня Р*680происходит или переход 2 в основное состояние (частьэтих переходов сопровождаетсяизлучением квантов света ашню2), или переход 3 науровень первичного акцептора Q c потерей энергии на величину дельтаE и Р680+. Далее происходит перенос электрона навторичные акцепторы (переход 5) и восстановление фотоокисленногохлорофилла реакционного центра от первичного донораZ (6). Реакциями 5 и 6 завершается цикл окислительно-восстановительных реакций, связанных с утилизацией энергиипоглощенного антенным хлорофиллом кванта света.Возможен обратный переход электрона (4) на возбужденный уровень Р680* споследующим испусканием кванта света ашню3 (7). Этот переход сопряжен с преодолением достаточно высокого барьераэнергии активации (дельтаE ~ 70 кДж/моль), поэтому вероятность обратного перехода 4 мала по сравнению с прямымпереносом электрона 5 на вторичные акцепторы.
Последнее обстоятельство обусловливает очень низкую интенсивностьпослесвечения. Таким образом, энергия, высвечиваемая в виде замедленной флуоресценции, выделяется в реакции обратногопереноса электрона с восстановленного акцептора Q на хлорофилл реакционного центра Р680 (в реакции рекомбинациизарядов): Р680+ + Q- = Р680 + Q + ашню3. За счет высоких скоростей миграции энергии возбуждения между молекуламихлорофилла замедленная флуоресценция высвечивается не пигментом реакционного центра, а светособирающими молекуламихлорофилла.
Именно поэтому спектры быстрой и замедленной флуоресценции идентичны. Кинетика затухания послесвеченияимеет формусложной экспоненты, которая может быть представлена в виде суммы нескольких компонент с различным временем жизни(тау от 0,5 мс до нескольких секунд). Это свидетельствует о наличии нескольких реакций, определяющих замедленнуюфлуоресценцию.
Скорость реакции рекомбинации зависит от скорости восстановления Р680+ донором Z и окисления Qпоследующими акцепторами. Количество компонент послесвечения и их время жизни сложным образом зависят от кинетикипрямого и обратного транспорта электронов в ближайшем донорно-акцепторном окружении реакционного центра ФС II.Интенсивность послесвечения (I) пропорциональна скорости рекомбинации (омега) Р680+ и Q- и квантовому выходуизлучения в акте рекомбинации (h). Скорость реакций рекомбинации определяется концентрацией реакционных центров всостоянии Р680+ Q-, а квантовый выход h зависит от квантового выхода энергии возбуждения Р680 при обратном переносеэлектронов (hвозб) и собственно квантового выхода флуоресценции (hфл):I = h*омега=k1*hвозб *hфл*[Р680 +Q-].Как было отмечено выше, концентрация Р680+ Q- зависит от скорости оттока электронов от реакционного центра - этимобстоятельством объясняется зависимость интенсивности икомпонентного состава замедленной флуоресценции от изменения скорости транспортаэлектронов в хлоропластах растений, вызванного изменением внешних условий.Фотоиндуцированное свечение подобно многим химическим процессам лимитированобольцмановским фактором, в параметры которого входят энергия активации и температура.
В связи с этим интенсивностьпослесвечения определяется соотношением:I = hомега= k2 *hвозб *hфл [Р680+ Q-] *exp(-(дельтаE-дельтамюаш)/КТ)Кроме того, разделенные заряды в реакционных центрах определенным образомориентированы в мембране, поэтому образование трансмембранного потенциала намембране хлоропласта (дельтамюаш) влияет на процессы прямого и обратного транспорта электронов и, соответственно, навыход послесвечения. Например, создание электрического диффузионного потенциала при быстром введении одновалентныхсолей металлов или наложение искусственного электрического поля на суспензию хлоропластов приводит к стимуляциизамедленной флуоресценции.Важным достоинством метода регистрации замедленной флуоресценции являетсявозможность получения информации от интактного объекта, что оказывается существенным, в частности, при проведениифизиологических исследований в полевых условиях.
Быстротаполучения информации позволяет использовать метод дляэкспресс-оценки устойчивости организмов к неблагоприятным факторам среды и фитотоксическим веществам. Например,применение метода в селекционной работе позволяет выявлять сортовые различия растений в устойчивости к температуре,водному дефициту, засолению, болезням, гербицидам.При исследовании замедленной флуоресценции растений используют методырегистрации кинетики затухания и кривых индукции миллисекундных компонент(зависимостей интенсивности послесвечения от времени освещения образцов).А. Измерение кинетики затухания замедленной флуоресценцииКинетика затухания флуоресценции растений после короткого (порядка 1 с) импульсасвета, включает в себя короткоживущие (тау= 10в-9 – 10в-7 с, быстрая флуоресценция) идолгоживущие компоненты (тау= 10в -6 - 10 с, замедленная флуоресценция).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
