PDF (1123296), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Зависимость потенциальной энергиисистемы от координат ядер многоатомной молекулы в основном и возбужденном состояниях различается. В наиболее простомслучае (двухатомная молекула) минимумы кривых потенциальных энергий в основном и возбужденном состояниях сдвинуты,поскольку орбиталь, заполняемая электроном в возбужденном состоянии, занимает большую область пространства, чем восновном состоянии, и положение равновесия в возбужденном состоянии, следовательно, соответствует большемумежъядерному расстоянию (поэтому сдвиг). Кроме того, форма таких потенциальных кривых в основном и возбужденномсостояниях также различается (рис.
2).В соответствии с принципом Франка — Кондона наиболее вероятным будет такой переход,при котором не произойдет изменений ни в положении ядер, ни в импульсе (принципвертикальности перехода между двумя электронными состояниями). Решение волновогоуравнения показывает, что хотя при поглощении кванта света возможны различныепереходы, однако наиболее вероятным будет переход, обозначенный сплошной стрелкойвверх на рис. 2. Иными словами, наиболее вероятное межъядерное расстояние длямолекулы с нулевой колебательной энергией соответствует середине АВ. В случаефлуоресценции наиболее вероятным будет испускание из середины CD (сплошная стрелкавниз), что соответствует наиболее интенсивной полосе спектра.
Флуоресценцияпроисходит с самого нижнего колебательного уровня первого возбужденногосостояния при переходе молекулы в основное состояние. Вероятность перехода извозбужденного в основное состояние может быть описана константой скорости перехода k,которая по физическому смыслу эквивалентна константе мономолекулярной реакции.Кинетика перехода может быть описана реакцией первого порядка dS*/dt=-kS*, где S* количество возбужденных молекул. После интегрирования волшебным образом I=Io*exp(kt), k – константа флуоресценции.При отсутствии безызлучательных процессов (фи= 1) длительность пребываниямолекулы в возбужденном состоянии определяется радиационным, или естественным,временем жизни тау0=1/константу флуоресценции. Это то время, в течение которого числовозбужденных молекул уменьшается в e раз.
В реальных ситуациях квантовый выходобычно меньше единицы, поскольку с флуоресценцией конкурируют безызлучательныепроцессы: интеркомбинационная конверсия с переходом в триплетное возбужденноесостояние, сопровождающееся изменением спина, внутренняя конверсия, диссипация втепло, фотохимическая реакция или дезактивация за счет тушения флуоресценции привзаимодействии с молекулами тушителя Q.В действительности квантовый выход флуоресценции меньше единицы вследствие существования в молекулебезызлучательных процессов; следовательно, реальное (или измеряемое) время жизни тау флуоресц окажется меньше тау):1/сумму констант происходящих процессов (флуоресценция, фотосинтез, интеркомбинационная конверсия в триплетноесостояние, диссипация в тепло (внутренняя конверсия), тушение*[Q]).
Квантовый выход флуоресценции в этом случаевыражается соотношением: фи=константа флуоресценции/сумму констант происходящих процессов, т.е. Фи=константафлуоресценции*время жизни.В отсутствие тушителя квантовый выход флуоресценции обозначают как фи фл0. Фи фл0/фи фл= 1 +константаq*[Q])/сумму всех констант без тушителя, то, обозначив время жизни в отсутствие тушителя через тау фл0 (непутать с тау0 которая вообще без побочных процессов), получим, что тау фл0 =1/ сумму всех констант без тушителя и (фифл0/фи фл) – 1 = тау фл0* константаq*[Q]=K[Q]. I=I0/(1+ K[Q]). Последнее уравнение называется соотношением Штерна иФольмера, а К — константой тушения.
Последняя легко определяется экспериментально при измерении интенсивностейфлуоресценции различных образцов, отличающихся концентрацией тушителя. Для этого достаточно оценить угловойкоэффициент прямой в координатах I без тушителя/(Iс тушителем - 1) и [Q].Исходя из определения квантового выхода флуоресценции фи=I фл/(I0-Iпрошедшего через объект), с использованием законаЛамберта — Бэра можно установить связь между интенсивностью флуоресценции I и молярным коэффициентом поглощения,а также концентрацией с: I=K*I0*(1-Т)*фи, где I0— интенсивность возбуждающего света, (1 — Т) — величина поглощения, Т— величина пропускания, К — коэффициент пропорциональности, зависящий от способа измерения.Так как D= - lg Т = эпсилон*с1, где D — оптическая плотность, то I=K*I0*(1-10 в степени -D)*фи. Выражение в скобкахможно разложить в ряд при небольших значениях D и ограничиться линейным членом: I примерно=2,3K*I0*эпсилон*cl*фиЭто означает, что при малых оптических плотностях (меньше 0,1-0,2) I пропорциональна концентрации флуоресцирующеговещества и интенсивности возбуждающего света.Точное измерение интенсивности флуоресценции осложняется целым рядом факторов: реабсорбцией флуоресценции,экранированием возбуждающего света другими молекулами, светорассеянием, гетерогенностью объекта, миграцией энергии,тушением флуоресценции.
При комнатной температуре квантовый выход флуоресценции хлорофилла в нативныхфотосинтетических мембранах составляет не более 3%. Низкотемпературная техника может ослабить влияние возбуждающегосвета, вызывающего побочные процессы. Флуоресценция хлорофилла в нативных фотосинтетических мембранахпродуцируется молекулами хлорофилла антенны и при комнатной температуре характеризуется главным максимумом 684-687нм и «плечом» в более длинноволновой области около 720-730 нм. В случае целых листьев из-за реабсорбции долядлинноволновой полосы возрастает. При комнатной температуре квантовый выход для фотосистемы 1 в несколько разменьше, чем для фотосистемы 2.Люминесценция — «холодное» свечение некоторых веществ (люминофоров); излучение, представляющее собой избыток надтепловым излучением тела при данной температуре и имеющее длительность, значительно превышающую период световыхволн.
Характеристики: спектр возбуждения, спектр люминесценции, квантовый выход, время жизни молекулы ввозбужденном состоянии. Она делится на уже описанную флуоресценцию (быструю люмин) и фосфоресценцию (медленнуюлюмин). Фосфоресценция – переход с нижнего колебательного уровня триплетного состояния T1 на основноевозбужденное (время жизни возбужденного состояния при фосфоресценции составляет порядка 10 в −2 – 10 в −4 с, т.к.синглет-триплетные переходы имеют квантовомеханический запрет – так может делать хлорофилл).Механизмы миграции хорошо отражает рис 3 иописанные ранее процессы.Рис. 3.
Схематическое изображение физическогомеханизма люминесценции: жирнымигоризонтальными линиями обозначены энергетическиесостояния молекулы люминесцирующего вещества; S0— основное (невозбужденное) состояние; S2, S2 и Т1— возбужденные состояния; тонкими горизонтальнымилиниями обозначены колебательные уровни (0, 1, 2.,.или 0’, 1’, 2’ и т.д.); в прямоугольниках показанонаправление спина возбужденного электрона (слева) поотношению к спину оставшегося электрона; ВК —внутренняя конверсия (переходы электрона безобращения спина); ИК — интеркомбинационнаяконверсия (переходы электрона с обращением спина).При поглощении энергии молекула переходит ввозбужденное состояние S1 или S2 (обозначено синимивертикальными стрелками). Часть поглощеннойэнергии преобразуется в тепло (обозначеноволнистыми стрелками), при этом молекула переходитна нижний колебательный уровень состояния S1 или трансформируется в состояние Т1 Возвращение молекулы из состоянияS1 или Т1 на исходный энергетический уровень может сопровождаться излучением света — флюоресценцией (обозначенатемно-зелеными стрелками) или фосфоресценцией (обозначена светло-зелеными стрелками).Люминесценция биологических объектов может быть собственной (первичной) либо возникать после соответствующейхимической модификации имеющихся веществ (вторичная), а также после введения так называемых флюоресцентных зондов.Флюоресцирующие соединения могут быть определены в очень низких концентрациях, часто в присутствии постороннихвеществ.
Поэтому регистрация люминесценции успешно используется для количественного определения многихбиологически важных веществ. Одним из наиболее ярко флюоресцирующих лекарственных соединений является хинин. Вкислых растворах он люминесцирует в синей области (450—475 нм). Чтобы определить его в плазме крови проводятосаждение белков метафосфорной кислотой и измеряют люминесценцию хинина прямо в фильтрате. Яркой синейфлюоресценцией обладает противогрибковый препарат гризеофульвин, он легко определяется в экстрактах из крови илимочи.
Барбитураты в щелочной среде обладают яркой зеленой флюоресценцией, их можно определить в экстрактах избиологического материала. После экстракции возможна количественная регистрация многих витаминов, напримервитамина Е, максимум флюоресценции которого лежит в УФ-области при 330 нм. Витамин В6 имеет синюю, а витамин А —зеленую флюоресценцию.
Витамины С, D, В12 и др. удается определить по вторичной люминесценции. Наркотическиевещества морфин и героин флюоресцируют очень слабо, но после обработки образцов серной кислотой с последующимвыщелачиванием возникает специфическая интенсивная синяя флюоресценция продуктов реакции. Этим методом удаетсяопределить до 0,02 мкг наркотика в пробе. Чувствительным лабораторным методом определения АТФ является регистрацияхемилюминесценции в присутствии люциферина и люциферазы светлячка. Люцифераза катализирует реакциювосстановленного люциферина с АТФ; продукт этой реакции — аденилат при окислении испускает свет.
По собственнойлюминесценции проводят контроль качества пищевых продуктов. Так, при длительном хранении молока и сливок рибофлавинокисляется в люмихром, что сопровождается изменением цвета флюоресценции от желто-зеленого к синему. Яйца,зараженные некоторыми видами бактерий рода Pseudomonas, при УФ-облучении начинают интенсивно флюоресцировать (засчет пигмента пиовердина, синтезированного этими бактериями).Регистрацию люминесценции используют в целях диагностики. Характерная первичная люминесценция желтозеленого цвета, возбуждаемая УФ-облучением при 365 нм, наблюдается в волосах, пораженных паразитическими грибками.Регистрация люминесценции позволяет получать важную информацию о физико-химических свойствах биологическихобъектов в норме и патологии.
Молекулярные механизмы работы цепи переноса электронов в митохондриях, целых клетках идаже в тканях изучают по изменению синей (440 нм) флюоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов, возбуждаемойпри 365 нм. При изучении структуры нуклеиновых кислот применяют акридиновый оранжевый и другие зонды. При этомопределение положения максимума люминесценции в спектре позволяет судить о структуре нуклеиновой кислоты.
Так,максимум акридинового оранжевого и двуспиральной нативной ДНК располагается в зеленой области спектра (530 нм), тогдакак в одноцепочечной ДНК и РНК он смещается в красную область (640 нм). Микрофлюориметрически с помощью зондованализируют ДНК непосредственно в клетках. В медицинской технике распространение получили неорганическиелюминофоры — вещества, способные к фото-, рентгенофлюоресценции и т.д.Биолюминесценция – видимое свечение организмов, связанное с процессами их жизнедеятельности; являет собой результатбиохимической реакции, в которой химическая энергия возбуждает специфическую молекулу, и та излучает свет.Наблюдается у нескольких десятков видов бактерий, низших растений (грибов), у некоторых беспозвоночных животных (отпростейших до насекомых включительно), у рыб. Светящиеся организмы иногда размножаются в таком количестве, чтовызывают свечение моря.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
