PDF (1123296), страница 12
Текст из файла (страница 12)
1.9). Теоретически, если числодлин волн, используемых для измерений, равно числу компонентов, можно проанализировать и более сложные смеси. Напрактике же редко удается осуществить количественный спектрофотометрический анализ более 2-3 соединений в однойсмеси. Критерием правильности анализа может служить совпадение сконструированного спектра, рассчитанного послеопределения концентраций, по уравнению типа приведенного выше, со спектром смеси, измеренным в опыте.При количественном спектрофотометрическом анализе главная задача исследователя – измерить концентрации, а значит, иоптические плотности растворов с наибольшей возможной точностью.
Можно показать, что наименьшая погрешность вопределении концентрации получается при оптической плотности раствора от 0,2 до 0.8.Есть несколько способов, позволяющих добиться максимальной точности спектрофотометрического анализа: а)разбавление слишком концентрированного раствора или б) уменьшение толщины образца; в) подбор длины волны,при которой обеспечивается попадание измеряемых величин оптической плотности в оптимальные пределы.Повреждающее и регуляторное действие света видимого диапазона. Сенсибилизаторы.Любой фоторегуляторный процесс включает несколько последовательных стадий:1)поглощение кванта света и образование возбуждённого состояния фоторецептора2)фотофизическая реализация энергии возбуждения3)Сенсибилизация фотохимической реакции4)образование промежуточных продуктов5)конечное проявление фотобиологических эффектовФотосенсибилизаторами называются вещества, выступающие в качестве первичных фоторецепторов в фотобиохимическихреакциях.Пигменты-сенсибилизаторы большинства фотобиологических процессов до сих пор не идентифицированы (о их природеможно судить только по спектрам действия фотобиологических эффектов).
Исключением является пигмент фитохром. Этодимер, каждый мономер которого содержит хромофор (фитохромобилин), присоединённый к апобелку тиоэфирной связью.Фитохром обладает фотоконверсией – под действием красного и дальнего красного света он способен менять своюконформацию с изменением максимума поглощения при 660нм (К) и 730 нм (ДК). Дальнекрасная форма фитохрома (Ф730)характеризуется наличием гидрофобной зоны, что позволяет фитохрому взаимодействовать с регуляторными и сигнальнымимолекулами.Принцип действия фотосенсибилизаторов основан на эффективном изменении активности ферментов, а такжепроницаемости мембран, при поглощении кванта света.
Поглощая свет, молекула сенсибилизатора претерпеваетфотохимическую реакцию (например, цис-транс изомеризацию), приводящую к изменению пространственной конфигурациифотохрома, что отражается на характере взаимодействия фотохрома с ферментом.Однако, не все фотосенсибилизаторы реагируют на красный свет . Пример процесса, индуцируемого синим светом, являетсяфототропизм. Основными рецепторами этих реакций являются флавиновые хромофоры. (за счёт фотосенсибилизированныхрибофлавином окислительных реакций происходит активация транспорта ауксинов через мембрану). Ещё к реакциям, которыеиндуцируются синим светом, относятся каротиногенез, фототаксис.Фотодинамическими называются фотосенсибилизированные деструктивные процессы в большинстве случаев протекающие сучастием кислорода.
Фотодинамические реакции разделяются на 2 типа, в зависимости от того, каким способом энергиясветового возбуждения передаётся на биологический субстрат.В реакциях I типа возбуждённый сенсибилизатор может осуществлять ОВР с различными молекулами (перенося либоэлектрон, либо атом водорода). В результате образуются реакционноспособные радикалы сенсибилизатора и субстрата, вступающие в химические реакции с кислородом.В реакциях II типа перенос энергии от возбуждённой в триплетном состоянии молекулы сенсибилизатора происходит ккислороду с образованием синглетной формы кислорода, который окисляет молекулы биологического субстрата.Однако существую фотодинамические реакции, не требующие участия кислорода. В частности, такие процессы протекают вДНК.
Энергия возбуждения в данном случае передаётся с молекул-сенсибилизаторов на азотистые основания, вызывая ихдимеризацию (это происходит под действием УФ излучения).Интересно, что данное действие является фотообратимым.Под действием УФ протекает реакция фотогидратации ДНК, когда к пиримидиновому кольцу присоединяется молекулаводы. Однако, это реакция протекает только в одноцепочечных НК, что имеет большое значение для процессов Репликации итранскрипции.УФ может вызывать появление пиримидовых аддуктов (аддукт – это 2 соединённых пиримидоных основания).
Эта реакцияимеет значение в качестве способа появления мутаций.Все вышеприведённые реакции соответствовали коротковолновому УФ излучению.Теперь рассмотрим реакции, которые вызывает длинноволновое УФ излучение. Данный свет индуцирует в ДНКобразование пиримидиновых димеров и одноцепочечные разрывы. Очевидно, что молекула ДНК не может служитьпервичным хромофором при действии УФ излучения (300-320 нм).
Следовательно, и димеры, и разрывы должныобразовываться не за счёт прямого поглощения квантов молекулой ДНК, а косвенным путём с участием определённыхмолекул – хромофором, тесно связанных с ДНК. Зависимость от молекулярного кислорода позволяет считать, что образованиеэтих фотопродуктов идёт по фотодинамическому механизму. Такой механизм осуществляется при наличии следующейкомбинации факторов: свет+хромофор+О2 . Как и любая фотохимическая реакция, фотосенсибилизированный процесс имеетначальную «световую стадию» и последующие «темновые стадии». Наиболее характерные первичные реакции заключаютсялибо в переносе электрона (или атома водорода), либо в переносе энергии (или электрона) на кислород.При фотосенсибилизированном образовании кислородо-зависимых одноцепочечных разрывов в ДНК в качестве эндогенныхсенсибилизаторов выступают НАДН, 4-тиоуридин и 2-тиоурацил. Установлено, что фотосенсибилизированная этимисоединениями инициация разрывов в ДНК осуществляется по фотодинамическому механизму с участием АФК.
При этомпервичной фотогенерируемой формой кислорода является супероксидный анион-радикал. Однако он обладает малойреакционной способностью по сравнению с радикалом ОН*. Соответственно, фотодинамическую реакцию одноцепочечногоразрыва ДНК можно представить как : S à S* à S+ + О’2- à Н2О2 à OH’ à ДНК à одноцепочечный разрывБилет 14Возбужденные состояния молекул. Схема Яблонского. Законы люминесценции.Полная энергия молекулы состоит из электронной, колебательной и вращательной составляющих. Молекулы имеютзаполненные и свободные электронные орбитали. Поглощение кванта света приводит к переходу электрона на незаполненнуюорбиталь с большей энергией, и молекула переходит на более высокий энергетический уровень (молекула в возбужденномсостоянии), при этом увеличивается и электронная и колебательная составляющая общей энергии молекулы (рис.1).Законы молекулярной люминесценции: правило Каши, закон Стокса—Ломмеля, правило Левшина, закон Вавилова.Правило Каши касается формы спектров люминесценции при возбуждении их светом разных длин волн.
Посколькуиспускание квантов люминесценции всегда происходит с низшего электронно-возбужденного уровня молекулы, спектрлюминесценции будет всегда одним и тем же независимо от того, на какой энергетический уровень попал электрон врезультате поглощения фотона. Это означает, что спектр люминесценции не зависит от длины волны возбуждающего света.Закон Стокса—Ломмеля обуславливает взаимное расположение спектров люминесценции и поглощения и формулируетсяследующим образом: спектр люминесценции в целом и его максимум сдвинут по сравнению со спектром поглощения и егомаксимумом в длинноволновую область.
это означает, что средняя энергия квантов люминесценции меньше средней энергиипоглощенных квантов. Причина этого явления заключается в превращении части энергии поглощенных квантов в тепловуюэнергию:hna = hnе + DQ, (14.4.86)где hna — энергия поглощенного фотона возбуждающего света; hn е — энергия фотона люминесценции; DQ — энергиятеплового движения молекулы.Правило Левшина, называемое также правилом зеркальной симметрии, утверждает, что нормированные спектрыпоглощения и флуоресценции, представленные в виде графиков e = f(n) и, зеркально симметричны относительнопрямой, перпендикулярной оси частот и проходящей через точку пересечения спектров n0, причем для n0 можно записать:n а +n f = 2n 0 , (14.4.87), где nа и nf — симметричные частоты поглощения и флуоресценции.
Частота n0 в выражении(14.4.87) может быть интерпретирована как частота чисто электронного перехода, т. е. перехода между нулевымиколебательными уровнями состояний S0 и S1.01Зеркальная симметрия спектров поглощения и флуоресценции характерна для сложных молекул и не наблюдается в случаепростых молекул. Ее можно объяснить тем, что геометрия молекул мало меняется при электронном возбуждении, арасстояния между колебательными уровнями и вероятности переходов на них у молекул в основном и электронновозбужденном состояниях близки.Более строгое квантово-механическое обоснование правила Левшина дал Блохинцев. Он показал, что спектры поглощения ифлуоресценции необходимо нормировать и строить в координатахот n иот n соответственно.Закон Вавилова устанавливает зависимость квантового выхода люминесценции от длины волны возбуждающего света.Согласно этому закону, фотолюминесценция может сохранять постоянный квантовый выход, если возбуждающая волнапреобразуется, в среднем, в более длинную, чем она сама.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
