Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина - Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция (1123292), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Общая скорость изменения концентрации катион-радикалалюцигенина в системе равна сумме всех этих скоростей В условиях стационарного состояния концентрацию катионрадикала можно принять за постоянную величину, тогда k1[Luc2+][e¯] = [⋅Luc+](k4[⋅OO¯] + k2[O2] + k3[Ox](11)иПамятуя о том, что интенсивность ХЛ равна произведению скоростиХЛ реакции на квантовый выход ХЛ, умножим оба члена уравненияна величину hCL k4[.OO¯] и получим, что При всей грубости сделанных допущений из уравнения следуютвыводы, подкрепляемые экспериментом: Интенсивность ХЛ линейно возрастает с концентрацией люцигенина [Luc2+].
При низких концентрациях супероксида, когда первое слагаемоев знаменателе незначительно, интенсивность Люц-ХЛ прямо пропорциональна концентрации супероксида [.OOO¯]. При высоких концентрациях, а также при малом вкладе темновыхреакций радикала люцигенина по сравнению с ХЛ реакцией (большаядоля первого слагаемого в знаменателе) возрастание ХЛ с ростомконцентрации супероксида становится менее выраженным.Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция371 Интенсивность ХЛ в стационарных условиях прямо пропорциональна скорости одноэлектронного восстановления люцигенина, т.е.величине k1[Luc2+][e¯]. Последний вывод показывает, что интенсивность ХЛ в системахс низкой скоростью одноэлектронного восстановления люцигенинабудет меньше, чем при высокой скорости этой реакции при однихи тех же концентрациях супероксида. И это действительно так.Например, в работе [137] отмечается, что разница между данными оконцентрации супероксида, определяемой по калибровке (интенсивность Люц-ХЛ как функция концентрации супероксида), проведенной при образовании супероксида Комплексом I (который способенвосстанавливать люцигенин до катион-радикала), и по калибровке сиспользованием системы ксантиноксидаза/гипоксантин (которая этоделать не в состоянии), может достигать одного порядка величины.
Второе обстоятельство — это весьма вероятное влияние электрического поля на Люц-ХЛ в митохондриях. Люцигенин – это двухвалентный катион, проникающий через липидную мембрану митохондрий. Простой расчет по уравнению Нернста показывает, чтоконцентрация Luc2+ в матриксе митохондрий при мембранномпотенциале –175 мВ примерно в 1 миллион раз больше, чем вовнемитохондриальном пространстве, поэтому выделение относительно небольшого количества супероксида в матрикс вызоветзначительно больший всплеск хемилюминесценции, чем даже значительного количества супероксида, выделенного наружу.
Изменениемембранного потенциала может изменить интенсивность Люц-ХЛсовершенно независимо от образования супероксидного радикаладыхательной цепью. Это обстоятельство нужно иметь в виду приинтерпретации данных хемилюминесцентных исследований.Исследование люцигенин-зависимой ХЛ клеток и тканейВ большинстве клеток Люц-ХЛ определяется выделением супероксида дыхательной цепью митохондрий. Отчасти это связано с темобстоятельством, что люцигенин накапливается в матриксе митохондрий [126], куда попадает ⋅ OO¯, образуемый дыхательнымКомплексом I, но также и с тем, что в нефагоцитирующих клеткахмитохондрии образуют больше супероксида, чем НАДФН-оксидазаклеточных мембран. В работе [126] было показано, что в суспензииальвеолярных макрофагов крыс ингибиторы дыхательного Комплекса I(ротенон) и III (антимицин) подавляли Люц-ХЛ, тогда как ингибиторКомплекса IV (цианид в концентрации < 100 мкМ) слегка усиливал372Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаХЛ.
Это соответствует поведению изолированных митохондрий[129], в которых супероксид образуется дыхательным Комплексом Iи в точке, предшествующей Комплексу III (вероятно, на уровне убисемихинона) [134]. Авторы делают вывод, что в макрофагах именномитохондрии служат источником супероксид-радикалов [126]. Нейтрофилы бедны митохондриями, в отличие от тканевыхмакрофагов и их предшественников – моноцитов крови.
В последних основным источником супероксида также служат именномитохондрии. В пользу этого говорят факты, полученные в работе[129], в которых показатели Люц-ХЛ (а именно, зависимость ХЛ отцианида, ротенона и миксотиазола) были совершенно одинаковымив интактных клетках и в митохондриях, изолированных из этихклеток. При этом основным источником ·OO¯, судя по измерениюЛюц-ХЛ и потребления кислорода клетками, был дыхательныйкомплекс I (НАДН-оксидоредуктаза), поскольку как в изолированных митохондриях, так и в целых клетках – моноцитах – как ХЛ,так и потребление кислорода подавлялась микромолярными концентрациями DPI [136], известного ингибитора ферментов-флавопротеинов, включая Комплекс I. В наших исследованиях на целых кусочках ткани печени такженаблюдалась хемилюминесценция, активируемая люцигенином изависящая от кислорода, поступающего из раствора.
Монооксид азота,связывающий супероксид, подавлял Люц-ХЛ, причем светосумма ХЛ,потушенной NO, была пропорциональна количеству добавленногомонооксида [138].V. Другие ХЛ-зонды на активные формыкислородаВ ряде работ описан в качестве ХЛ зонда на АФК сходное с люминолом соединение 8-амино-5-хлор-7-фенилпиридо[3,4-d]пиридазин1,4-(2H, 3H)дион (L-012), структура которого показана на рис.
9. Прифизиологических условиях, интенсивность ХЛ нейтрофилов, стимулированных опсонизированным зимозаном, была приблизительно в100 и 10 раз выше в присутствии L-012, чем в присутствии люминолаи аналога люциферина MCLA (2‑метил-6-[p-метоксифенил]-3,7-дигидроимидазо[1,2-a]пиразин-3-он), соответственно [139]. Супероксидный радикал можно определять по ХЛ с целентеразином (2-(4-гидроксибензил)-6-(4- гидрофенол)-8-бензил-3,7-дигидроимидазо[1,2-альфа]пиразин-3-он) [140]. В цитированной работе изуСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция373Рис. 9. ХЛ-зонды, чувствительные к супероксиду.чали вклад внеклеточного компонента в генерацию супероксидногорадикала, вызванную эпилептическим приступом, и определялироль НАДФН-оксидазы как источника этого радикала.
Показано, чтоэпилептический припадок активирует мембранную НАДФН-оксидазуи приводит к увеличению продукции супероксидного радикала. Для определения супероксида используют также MCLA. В работе[141] детально описан механизм действия этого ХЛ-зонда и показано, что с его помощью удается регистрировать образование супероксида на целых перфузируемых органах лабораторных животных.Недостаток MCLA состоит в том, что он реагирует также с растворенным кислородом, давая фоновую ХЛ.
Кроме того, это соединениеобладает антиоксидантным действием в результате захвата свободныхрадикалов [142]. Сопоставление разных ХЛ методов анализа АФК,выделяемых кровеносными сосудами, можно найти в обзоре [143]. Для определения NO используется люминесцентное свечение,выделяющееся в результате реакции с озоном. При смешивании окисиазота и озона наблюдается яркая ХЛ: NO + O3 = NO2 + O2 + фотон. Использование ХЛ для анализа NO, образуемого сосудорасширяющими лекарственными препаратами, описано в работе [144].NO, образованный эндотелиальными клетками сосудов, определяютпри изучении механизмов патологии сосудистого эндотелия. Нарядус электрохимическими методами и ЭПР, описаны ХЛ-методы измерения продукции NO культурами клеток, обеспечивающие надежноеи чувствительное определение монооксида азота [145].374Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаVI.
Кумарин-активируемаяхемилюминесценцияХемилюминесцентные (или хемилюминогенные, chemiluminogenic)[46, 146, 147] зонды – химически активные молекулы, мало того –молекулы, связывающие свободные радикалы, а следовательно,влияющие на процессы, протекающие в живой клетке, причем тесамые, которые мы изучаем. Дискуссию о роли вмешательства люцигенина в образование супероксидного радикала мы уже рассмотреливыше.
Между тем, в случае органических радикалов, в том числерадикалов полиненасыщенных жирных кислот, существует принципиально иной метод усиления свечения, основанные на переносеэнергии электронного возбуждения от молекулы продукта свободнорадикальных реакций на молекулу-активатор ХЛ. На сегодняшний деньнаиболее эффективным физическим активатором свечения можносчитать изохинолизиновый кумарин С-525, который усиливает ХЛ,сопровождающую цепное окисление липидов в липосомах, более,чем в 1500 раз, никак не влияя при этом на ХЛ при взаимодействиирадикалов кислорода (гидроксила и супероксида) [52].
Немногимменее активными оказались два другие родственные кумарина: С-314и С-334 [148]. Формулы этих соединений даны на рис.10. Активированная кумарином C-525 была первоначально обнаружена в опытах с суспензией фосфолипидов (липосом), в которых перекисное окисление было запущено добавлением солей Fe2+. Позднеебыло показано, что C-525 в микромолярных концентрациях усиливаеттакже ХЛ в микросомах печени крысы, где липидную пероксидациювызывали добавлением гидропероксида трет-бутила (t-BHP).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
