Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина - Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция (1123292), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Чтобы понятьсуть развернувшейся дискуссии, следует обратиться к схеме реакций, ответственных за хемилюминесценцию люцигенина [129].Первая из этих реакций – образование катион-радикала (⋅Luc+) излюцигенина, который в нейтральном водном растворе представляетсобой двухвалентный катион (Luc2+) (см. также рис.
7): 1) Luc2+ + e¯ → ⋅Luc+. Взаимодействие катион-радикала люцигенина с супероксидомприводит к образованию нестойкого соединения – люцигениндиоксетана (Luc=O): 2) ⋅Luc+ + ⋅OO¯ → Luc=O. При спонтанной реакции распада Luc=O образуются две молекулыN-метилакридона, одна из которых оказывается в электронно-возбужденном состоянии: 3) Luc=O → метилакридон* + метилакридон 4) метилакридон* → метилакридон + фотон. Из этой схемы следует, что скорость хемилюминесцентной реакции (3) зависит не только от концентрации ⋅OO¯, но и от скоростиреакции одноэлектронного восстановления люцигенина (1).
В стационарных условиях скорости всех стадий равны:(7) k1[Luc2+][e¯] = k2[⋅Luc+][·OO¯] = k3[Luc=O] = v. При этом(8) ICL= ηCL⋅v.366Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаТаким образом, интенсивность Люц-ХЛ пропорциональна нетолько концентрации люцигенина [Luc2+] и супероксидного радикала[·OO¯] , но и скорости восстановления люцигенина k1[e¯], гдеe¯ – концентрация одноэлектронных восстановителей в системе, аk1 – константа скорости реакции.
Критика Люц-ХЛ как метода определения концентрации ·OO¯основана на том, что автоокисление катион-радикала люцигенинакислородом воздуха может само по себе давать супероксидные радикалы [128, 130]. Основной аргумент в пользу такого предположения заключался втом, что восстановление цитохрома c в системе ксантин/ксантиноксидаза ускорялось люцигенином, причем это ускорение снималось СОД.Развитие событий можно представить в виде схемы [118, 128]:ксантиноксидаза2+→ Мочевая кислота + ⋅Luc+ 1) Ксантин + Luc 2) ⋅Luc+ + O2 → Luc2+ + ⋅OO¯. Эта реакция, по мнению авторов, давала дополнительное (до70%) образование супероксидного радикала по сравнению с основнойреакцией:ксантиноксидаза→ Мочевая кислота + ⋅OO¯.3) Ксантин + O2Одновременно идет реакция:ксантиноксидаза3+ 4) Ксантин + Цит c→ Мочевая кислота +2++ Цит c ,которая конкурирует с реакцией (3), снижая продукцию супероксида.
Если бы не было этой конкуренции с цитохромом с, «должно былобы наблюдаться еще большее увеличение продукции супероксида,обеспечиваемое люцигенином», пишут авторы [130]. Однако вывод о том, что реакция (2) может вносить заметныйвклад в общую скорость образования супероксидных радикалов (аследовательно, Люц-ХЛ) стал, в свою очередь, предметом жесткойкритики [129, 131].
Прежде всего было показано, что при низкихконцентрациях люцигенина (менее 20 мкМ), при которых вкладреакции (2) был незаметным (менее 20 мкМ), в различных биохимических системах наблюдалось образование супероксидныхрадикалов. При этом был отмечен параллелизм между тремя показателями образования супероксида: (1) интенсивность Люц-ХЛ, (2)скорость потребления кислорода, оцененная методом полярографиии (3) образование специфического спинового аддукта при ракцииСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция367·OO¯ с ловушкой 5-(диэтоксифосфорил)-5-метил-1-пироллинN-оксидом [129]. Концентрации люцигенина варьировали от 1до 5 мкМ, объектами служили ксантин + ксантиноксидаза, липоамиддегидрогеназа + НАДН, изолированные митохондрии, митохондрии в интактных клетках и НАДФН-оксидаза фагоцитов.
Междуинтенсивностью ХЛ и зависимым от СОД восстановлением феррицитохрома наблюдалась прямая пропорциональная зависимость всистеме ксантин + ксантиноксидаза и НАДФН-оксидазной системефагоцитов. В двух ферментативных окислительных системах, продуцирующих H2O2, а не супероксид (глюкозооксидаза + глюкоза иксантиноксидаза + НАДН) Люц-ХЛ практически не имела места. Авторы цитируемой работы пришли к выводу, что никакого влияния на ХЛ так называемая рециклизация люцигенина (т.е.
реакция 2) вэтих случаях не оказывала. Однако они делают оговорку, что это имеетместо при невысоких (менее 20 мкМ) концентрациях люцигенина всистеме, подразумевая, что при более высоких концентрациях деломожет обстоять иначе [129]. Еще более категорические возражения против роли «рециклизации» люцигенина в развитии Люц-ХЛ высказали И.Б.Афанасьев исотрудники [131].
Прежде всего их расчеты показали, что равновесиев обратимой реакции: Luc1++ O2 ⇔ Luc2+ + ·OO¯резко сдвинуто влево (константа равновесия = 106), и таким образомсупероксид в реакции «рециклизации» вряд ли образуется в ощутимых количествах. С другой стороны, были получены данные, которыепоказали, что объяснение Лёчевым и Фридовичем их собственныхрезультатов ошибочно.
Схема обсуждаемых реакций дана на рис. 8.Согласно этой схеме, супероксид-радикал, образуемый в системексантиноксидаза (XO) + ксантин (X) (реакция 1), восстанавливаетцитохром с до двухвалентного состояния (2), что лежит в основеклассического метода определения ⋅OO¯. При взаимодействии⋅OO¯ с люцигенином (Luc2+), образуется катион-радикал (⋅ Luc+),стационарная концентрация которого пропорциональна интенсивности Люц-ХЛ (см. уравнение 8). Согласно Лёчеву и Фридовичу [128,130], ⋅Luc+ способен восстанавливать кислород с образованием катион-радикала (реакция 4), что и приводит к дополнительному СОД‑зависимому восстановлению цитохрома3+ (реакция 2). Афанасьев исотрудники объяснили данный эффект прямым восстановлениемцитохрома катион-радикалом люцигенина (реакция 5) [131].
Ихвывод, полученный на основании расчетов и экспериментальныхданных, однозначен: люцигенин (в форме катион-радикала) участвует368Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаРис. 8. Реакции в системе ксантин/ксантиноксидаза в присутствии люцигенинаи цитохрома с (объяснения в тексте).в восстановлении цитохрома с, но не в образовании дополнительногоколичества супероксид-радикалов. Все эти данные подтверждаютадекватность ХЛ метода для определения супероксида в химическихи биологических системах.Люц-ХЛ при изучении изолированных митохондрийВопрос о применимости Люц-ХЛ для изучения образования супероксидных радикалов в митохондриях был специально рассмотрен вработе [129]. Добавление люцигенина не приводило к существенномуувеличению потребления кислорода митохондриями, цитохромоксидаза в которых была полностью блокирована цианистым калием.
Небыло, конечно, никакого дополнительного потребления кислородапри добавлении к суспензии таких митохондрий люцигенина в концентрациях от 20 мкМ и меньше. Это исключает дополнительноеобразование супероксида в системе в результате «рециклизации»люцигенина, по крайней мере при его невысоких концентрациях. Место образования супероксидных радикалов в дыхательнойцепи – предмет особого рассмотрения (см. в частности, работы [22,132–135]), и мы кратко остановимся лишь на нескольких работах,где этот вопрос решался, в том числе и методом Люц-ХЛ. При использовании сукцината в качестве источника электроновдля цепи переноса электронов в митохондриях, цианид, увеличиваяконцентрацию электронных переносчиков в восстановленной форме(и, тем самым, вероятность образования супероксида за счет ихвзаимодействия с растворенным кислородом), значительно увеличивал Люц-ХЛ. Ротенон и микседол, блокирующие перенос электронов от дыхательного Комплекса I на коэнзим Q и от коэнзим Q на Комплекс III, соответственно, полностью снимали развитие Люц-ХЛ [129].Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция369 В другой работе той же группы [136] методом Люц-ХЛ былопоказано, что ингибитор НАДН оксидоредуктаз дифенилениодоний(DPI) не влияет на образование супероксида изолированнымимитохондриями, если субстратом служит сукцинат (субстрат длявосстановления дыхательного Комплекса II), но подавляет Люц-ХЛ,если в качестве субстрата служил пируват или НАДН (способныевосстанавливать Комплекс I).
Эти данные подтверждают существование по меньшей мере двух участков образования супероксидамитохондриями: на уровне дыхательного Комплекса I (DPI-чувствительного, но не чувствительного к ротенону и микседолу) и участка:убихинон–дыхательный Комплекс III (нечувствительного к DPI, ночувствительного к ротенону и микседолу). По данным работы [134],соединением, которое восстанавливает кислород, в этом случаеслужит убисемихинон. Вероятно, существует возможность образования супероксида и в других звеньях дыхательной цепи. Имея в виду обширное применение Люц-ХЛ для анализа супероксидных радикалов в митохондриях и целых клетках следуетвнимательно отнестись к возможным недостаткам этого метода.«Зациклившись» на проблеме рециклизации люцигенина, каквозможной (но маловероятной) причине ошибок в количественномопределении супероксида по ХЛ, исследователи нередко упускаютиз виду два других источника возможных ошибок: (1) влияния скорости одноэлектронного восстановления люцигенина на уровенькатион-радикала, который и определяет интенсивность Люц-ХЛ, и(2) влияния мембранного потенциала на внутримитохондриальнуюконцентрацию люцигенина и его катион-радикала.
Рассмотрим вначале первый источник ошибок. Путь метаболизмалюцигенина в исследуемой системе начинается с его превращенияв катион-радикал под действием внутриклеточного восстановителя,например, восстановленной формы дыхательного Комплекса I:1) Luc2+ + e¯⋅Luc+. Скорость этой реакции равна(9)–где [e ] – концентрация восстановленной формы переносчика. Катион-радикал люцигенина может вступать в несколько реакций,в том числе в реакцию рециклизации: 2) ⋅Luc+ + O2Luc2+ + ⋅OO¯ ,в темновые реакции с другими окислителями3) ⋅Luc+ + OxLuc2+ + ⋅Ox¯,370Ю.А.Владимиров, Е.В.Проскурнинаили, наконец – в хемилюминесцентную реакцию с супероксидом:Luc=O… → фотон. 4) ⋅Luc+ + ⋅OO¯ Скорости соответствующих реакций по закону действия массравны:v2 = –k2[O2][⋅Luc+],v3 = –k3[Ox][⋅Luc+], v4 = –k4[⋅OO¯][⋅Luc+].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
