Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина - Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция (1123292), страница 4
Текст из файла (страница 4)
При помещении в кювету суспензии фагоцитирующих клеток наблюдается относительно слабая фоновая ХЛ,однако после добавления стимула, вызывающего продукцию супероксидного радикала и других АФК, наблюдается развитие вспышкиХЛ (ХЛ-ответ, CL-response). Следует признать, что собственная ХЛ для изучения образованиярадикалов клетками в настоящее время используется редко по причинеслабости свечения. После работ Эллана и Луза 1976 г. [17], в которыхв качестве активатора ХЛ фагоцитов использовался люминол, методЛХЛ практически вытеснил метод анализа СХЛ.
Обычно добавлениелюминола увеличивает интенсивность ХЛ клеток более, чем в 1000раз, а это означает, что для анализа можно брать в 1000 раз меньшебиологического материала.356Ю.А.Владимиров, Е.В.Проскурнина Однако надо помнить, что информация, даваемая собственной ХЛи ЛХЛ, не идентична, поскольку интенсивность ЛХЛ определяется восновном концентрацией гипохлорит + H2O2 или радикалов гидроксила + супероксид, тогда как СХЛ зависит обычно от скорости липидной пероксидации в системе. В качестве работы, где собственная ХЛбыла с успехом использована, можно упомянуть о публикациях Г.И.Клебанова и сотр., в которых методами анализа ТБКРП (реактивныхпродуктов тиобарбитуровой кислоты) липидной пероксидации [89] исобственной ХЛ [90] была показана активация пероксидации липидовлипопротеинов низкой плотности плазмы крови стимулированныминейтрофилами.
Эта активация осуществлялась водорастворимымиАФК, проникающими через диализную мембрану, но только в присутствии ионов Fe3+ в водорастворимой форме (в комплексе с АДФ).Последовательность событий при этом можно представить такимобразом: 1) Стимулирование клеток зимозаном → выделение ·OO¯ → → образование HOOH 2) Fe3+ + ·OO¯ → Fe2+ + O2 3) HOOH + Fe2+ → Fe3+ + HO¯ + ·OH → цепное окисление липидов. В пользу такой схемы говорит то, что активация ПОЛ снималаськак супероксид дисмутазой (подавление стадии 2), так и каталазой(подавление реакции 3).
Имеется много данных о том, что описанные события имеютважное значение для образования окисленных форм липопротеиновплазмы крови, что, в свою очередь, существенно для развития атеросклероза (см. обзоры [91–94]).III. Люминол-зависимая ХЛ клетокИзмерение люминол-зависимой ХЛ клеток крови широко используется для изучения функционального состояния фагоцитарного звенаиммунитета. Появление и взаимодействие чужеродного материала с фагоцитирующей клеткой запускает сложный каскад физиологических иметаболических процессов, начало которого – взаимодействиерецепторов на поверхности клетки с разного рода лигандами, включаяиммунные комплексы, а конец – образование супероксидных радикаловпри переносе электрона с НАДФН на O2 , метаболизм этих радикалов,разрушение бактериальной клетки и запуск биосинтеза множествафизиологически активных соединений в клетке-фагоците (см.
обзорыСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция357[20, 21, 95, 96]). ЛХЛ вызывается окислением люминола активнымиформами кислорода и хлора и взаимодействием окисленных формлюминола с супероксидным радикалом или пероксидом водорода.Для понимания информации, которую дают исследования ЛХЛ, остановимся несколько подробнее на механизме этих реакций.Механизм реакций, ответственныхза свечение люминолаЛитературные данные о механизме реакций, ответственных засвечение люминола, обобщены в статье Д.И.Рощупкина и сотр.,которые предложили также схемы соответствующих реакций ([97],рис.
5). В упрощенном виде процесс протекает в три этапа. Перваястадия – это окисление люминола каким-либо сильным оксидантом,например, радикалом или окисленной формой металла переменнойвалентности (рис. 5, реакции 1 и 2): Образовавшийся оксильный радикал люминола может вступатьв различные реакции, которые не приведут к ХЛ: взаимодействоватьс другим радикалом люминола или с одноэлектронным окислителемR·, подвергаться дальнейшему окислению или взаимодействовать смолекулой антиоксиданта InH: ·LH + InH → LH2 + In·. Второй и весьма важный этап в развитии ХЛ-реакции – появлениеключевого гидропероксидного продукта (4-гидроперокси-1-окси-5аминофталазин-4-олата), которое в биохимических системах обычнопроисходит при взаимодействии радикала люминола с супероксидом(рис.
5, реакция 3): Собственно ХЛ-реакция начинается с превращения гидропероксида(LOOH) в соединение, содержащее эндопероксидную химическуюгруппу (2,3-перокси-ди[гидроксиметиленил]фениламин) (реакции 4 – 6на рис. 5): LHOOH¯ → пергидрокислота → эндопероксид-N=NH→ эндо- пероксид-H + N2↑. На заключительном этапе в эндопероксидной группе разрываетсясвязь между атомами кислорода и образуется молекула монопротонированной аминофталевой кислоты в электронно-возбужденномсостоянии с последующим испусканием кванта света (реакции 7 и 8 нарис.
5).358Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаРис. 5. Одноэлектронное окисление люминола (объяснение в тексте). Путь превращения гидропероксидного ключевого продукта доэлектронно-возбужденной аминофталевой кислоты (реакции 4–8 нарис. 5) – один и тот же при действии многих оксидантов [97, 98]. Носамо образование гидропероксида может идти разными способами,на чем мы подробнее остановимся чуть позже.Использование люминол-зависимой ХЛдля определения общей антиоксидантной активностиАнтиоксиданты оказывают влияние на интенсивность люминол-зависимой ХЛ.
На этом основан хорошо известный метод анализа общегосодержания антиоксидантов в опытах in vitro с использованиемтаких источников радикалов, как 2,2'-азо-бис(амидинопропан)дигидрохлорид (ABAP) [99–102] для водорастворимых или 2,2'-азобис(2,4-диметил-валеронитрил) (AMVN) для гидрофобных антиоксидантов [103]. В этих исследованиях действие антиоксидантовпроявляется либо в снижении интенсивности хемилюминесценциина определенном этапе ХЛ-ответа, либо в задержке развития ХЛ,мерой чего может служить латентный период, или период индукции.В присутствии кислорода наиболее вероятная цепь реакций, приводящих к ХЛ, выглядит следующим образом:Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценцияИсточник радикалов (например, ABAP) → R·359ROO· ROO· + LH2·L¯ → реакции 4–7 (рис.
5) → hν. Ловушки (перехватчики) радикалов могут прерывать эту цепь наразных этапах, ликвидируя либо ранние, алкильные и пероксильныерадикалы (R· и ROO·), либо более поздние – радикалы люминола(·L¯ или ·LH). Без детального анализа нестационарной кинетикиреакций непросто различить эти два механизма, но в ряде случаевэто и не нужно. Детали методов оценки общей антиоксидантнойемкости образца (total reactive antioxidant potentials (TRAP)) и общейантиоксидантной активности (total antioxidant reactivity (TAR)) описаны в работах [99] и [104], см.
также обзор [105]. Схема реакций, приводящих к ХЛ в подобных системах, недо конца известна. Поскольку как супероксид анион-радикал, таки анион гидропероксида люминола, участвующие в цепи превращений люминола (рис. 5), устойчивы только в щелочной среде,неудивительно, что квантовый выход люминол-зависимой ХЛ резкоувеличивается при возрастании рН [99]. По-видимому, в нейтральной и кислой среде возрастает доля побочных реакций, не сопровождающихся хемилюминесценцией. В модельных опытах обычноиспользуют среды с рН от 8,3 до 9 и выше, что далеко от физиологического стандарта.
В этом состоит довольно серьезное ограничениеприменения метода ЛХЛ в биологии.Люминол как метод определения активности пероксидазПри взаимодействии люминола с пероксидазами в присутствии пероксида водорода наблюдается довольно яркая ХЛ, механизм которойисследовался многими методами, включая метод остановленногопотока (stop-flow) [106]. Известно, что при смешивании HOOH с пероксидазой хрена(EC I .II. I. 7) образуется Соединение I (Complex I), которое при стоянии переходит в Соединение II (литературу см. [107]). Литературныеданные о стехиометрии этих превращений, а также собственные измерения быстрой кинетики ХЛ и поглощения света в системе пероксидаза (E), пероксид водорода и люминол (L) при концентрациях,близких к стехиометрическим, позволили Кормье составить схемуреакций, которую мы приводим с некоторыми изменениями в обозначениях [106]:E + H 2O 2С1(1)С1 + LH2С2 + ·LH(2)360Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаС2 + LH2E + ·LH(3)hν + продукты.(4) 2·LH + H2O2 Как уже было сказано, последняя реакция идет через стадию образования 3-аминофталата в электронно-возбужденном состоянии.Были определены константы скорости второго порядка реакций(2) и (3), которые оказались равными 2,3×106 моль–1с–1 и 7,2×104моль–1с–1, соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
