Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина - Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция (1123292), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Прямой метод анализа радикалов – метод электронного парамагнитного резонанса или ЭПР. В принципе он позволяет не только обнаруживать, но и идентифицировать многие радикалы путем анализасверхтонкой структуры сигналов ЭПР. Однако в биологическихсистемах он часто оказывается недостаточно чувствительным из‑закрайне низкой стационарной концентрации радикалов в клеткахи тканях. Например, обнаружить непосредственно методом ЭПРрадикалы, образующиеся при взаимодействии ионов Fe2+ с гидропероксидами липидов, удалось только в проточной системе с большимрасходом реактивов [30] или с использованием спиновых ловушек[31]. Последние могут, однако, влиять на протекающие в системебиохимические реакции или разрушаться в ходе некоторых из них.Метод хемилюминесценции (ХЛ) обладает тем преимуществом,что, во-первых, он обычно не связан с изменением хода процессовв растворах, клетках или даже целых тканях, где регистрируется свечение, а во-вторых, весьма чувствителен при обнаружении именновысокореакционных радикалов.
Дело в том, что методом ХЛ непосредственно определяется не концентрация радикалов, а скорость реакции, в которой они образуются.В самом общем случае реакция, в которой образование радикаловприводит к ХЛ, может быть представлена схемой:k2kе→ P* → P + фотон.→ R· … Интенсивность свечения пропорциональна скорости последнейреакции ICL = K⋅ke[P*],(1)k1где K – коэффициент, который характеризует чувствительность прибора к излучению с данным квантовым выходом и спектром.
Из-завысокой скорости реакций превращения радикалов [R·], в системемгновенно устанавливается стационарное состояние, при котором346Ю.А.Владимиров, Е.В.Проскурнинаскорости всех последовательных реакций одинаковы. Отсюда ясно,что интенсивность ХЛ пропорциональна скорости образованиярадикалов v1 ICL = K⋅ke[P*] = K⋅v1.(2) Мы видим, что при прочих равных условиях между скоростьюобразования радикалов и их стационарной концентрацией имеетсяпрямая зависимость, т.к. ICL = K⋅v1 = K⋅k2[R·].(3)Таким образом, метод ХЛ отражает концентрацию радикалов всистеме, как и методы спектрофотометрии или ЭПР. Но в отличиеот ЭПР, показания хемилюминометра не зависят от того, какова реакционноспособность радикалов.
В нашей схеме эта величина определяется константой k2 скоростиреакции исчезновения радикалов R·. Стационарная концентрациярадикалов определяется уравнением: K⋅v1 =K⋅k2[R·] откуда [R·] = v1 / k2.(4) Методом ЭПР (как и другими методами спектроскопии илифлуориметрии) определяется именно стационарная концентрациявещества, в нашем случае радикалов [R·].
При увеличении реактивности радикалов, т. е. с ростом k2 величина [R·] падает, а вместе с темуменьшается регистрируемый сигнал. Даже если активных радикаловобразуется много, их будет не видно из-за высоких значений k2. Интенсивность ХЛ, напротив, не зависит от реакционной способности радикалов, т.к. при увеличении реактивности радикалов одновременно ив той же мере снижается стационарная концентрация радикалов, ихпроизведение остается постоянным, а вместе с тем не происходит иизменения интенсивности ХЛ (уравнение 3).
Иными словами, методХЛ регистрирует даже самые активные радикалы, концентрациякоторых в изучаемой системе может быть исчезающее мала, и вэтом – его уникальность и преимущество перед другими методамиобнаружения радикалов в химических и биологических системах.Чем активнее радикал, тем труднее его непосредственно обнаружитьметодом ЭПР, но для ХЛ этого ограничения не существует.Приборы для измерения хемилюминесценцииВремя, когда для измерения слабого свечения приходилось охлаждатьфотоумножитель жидким азотом [6–12] или твердой углекислотой[3–5], вероятно, ушло безвозвратно. Современные фотоумножителии методы компьютерной обработки сигналов позволяют проводитьСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция347Рис.
2. Портативный хемилюминометр Lum-5773 (http://www.powergraph.ru/hard/lum.asp). A – внешний вид прибора: 1 – корпус, 2 – электромотор для мешалки,3 – мешалка, 4 – кювета, помещенная внутрь светоизолированного термостата,5 – светоизолированная трубочка для добавки растворов по ходу измерения.Приемное устройство расположено под кюветой.Б – изображение экрана компьютера с записью кривой хемилюминесценциифагоцитов, приготовленных из моноцитов здорового донора (слева) и больногоишемической болезнью сердца (справа). Стрелками показаны моменты добавкилюминола (Л) и стимула ФМА (С). Запись и обработка кривых осуществленас помощью программы PowerGraph (http://www.powergraph.ru/hard/lum.asp).Измерения проведены совместно с М.В.Биленко и С.А.Павловой [225].регистрацию даже собственного свечения клеток и тканей, не говоряуже об активированной ХЛ.
Однако специализированных приборов,непосредственно приспособленных для регистрации кинетикислабой ХЛ, сопровождающей образование свободных радикалов,выпускается мало. Недавно в нашей лаборатории совместно смалым предприятием ИнтерОптика был разработан портативныйхемилюминометр, обладающий достаточной чувствительностьюи снабженный современной программой обработки данных PowerGraph (рис. 2).Собственная и активированная хемилюминесценцияОткрытие сверхслабого, или лучше сказать, собственного свеченияклеток и тканей (СХЛ) [6–9] инициировало серию исследований как вСССР (см.
монографии [11, 32, 33], так и за рубежом [14, 34–46], пос348Ю.А.Владимиров, Е.В.Проскурнинакольку ее использование дало новый импульс изучению свободныхрадикалов в жизни клеток и развитии патологических состояний[33]. Но метод этот имеет два недостатка [47, 48]. Во-первых, из-занизкой интенсивности свечения измерение СХЛ требует не толькоприменения весьма чувствительной, а следовательно дорогой,аппаратуры, но и большого количество материала для анализа, чтодля биологии и медицины весьма нежелательно, а часто простоневозможно. Во-вторых, метод малоспецифичен, т.к. за сверхслабоесвечение в биологических объектах могут отвечать реакции многихактивных частиц: радикалов и пероксидов [11, 33, 49].
Выход заключается в использовании определенных веществ,получивших название активаторов ХЛ (по-английски, enhancers –усилителей). По механизму действия активаторы распадаются на двечетко различающиеся группы, которые можно назвать химическимии физическими активаторами [50]. Химические активаторы ХЛ, называемые также ХЛ-зондами, –это соединения, вступающие в реакции с АФК или органическимисвободными радикалами, в ходе которых образуются молекулыпродуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое приэтом свечение связано с переходом молекул в основное состояние,что приводит к высвечиванию фотонов [51]: Активатор + радикалы → продукт* → продукт + фотон. Хорошо известными представителями таких активаторов могутслужить люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион,гидразид 3-аминофталевой кислоты) и люцигенин (динитрат 10,10'‑диметил-9,9'-биакридиния).
Схемы их превращений, приводящих ксвечению, будут рассмотрены ниже. Физические активаторы не вступают в химические реакции ине влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, темне менее, многократно усиливают интенсивность ХЛ. В основе ихдействия лежит физический процесс переноса (миграции) энергиис молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор: Радикалы → продукт* → продукт + фотон 1 (неактивирован- ная ХЛ) Продукт* + активатор → продукт + активатор* → → фотон 2 (активированная ХЛ).
Усиление свечения активатором происходит в том случае, есликвантовый выход излучательного перехода (люминесценции) вовтором случае выше, чем в первом. Наиболее эффективным физическим активатором ХЛ при перекисном окислении липидов служитСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция349производное кумарина С-525; его добавление к системе, где идетреакция липидной пероксидации, усиливает свечение более, чем в1500 раз [52].II. Собственная хемилюминесценция клетокПри взаимодействии между собой АФК (см.
литературу в [11]), в реакциигипохлорита с HOOH, при взаимодействии пероксинитрита с белками[53–55], а также при цепном (перекисном) окислении липидов [33]наблюдается очень слабое («сверхслабое») свечение [6, 47].Механизм образования молекулв электронно‑возбужденном состоянииКак известно, ХЛ называют свечение, сопровождающее химическиереакции. Наличие такого свечения означает, что энергия, котораявыделяется на одной из стадий химического процесса, протекающегов системе, оказывается достаточной для образования одного изпродуктов реакции в электронно-возбужденном состоянии: A + B → P* + другие продукты (хемилюминесцентная реакция) P* → P + hν (люминесценция).
Спектр ХЛ и квантовый выход Qlum второй из этих реакций – этоспектр и квантовый выход обычной фотолюминесценции продукта.В большинстве биохимических реакций продукты обладают оченьнизким квантовым выходом фотолюминесценции, близким к нулю.Однако и образование возбужденных молекул в ХЛ реакции Qexтоже обладает низким выходом, поскольку большая часть молекулв химических реакциях, протекающих в водной среде при обычныхтемпературах сопровождается образованием молекул не в возбужденном, а в основном электронном состоянии: A + B → P. Общийквантовый выход ХЛ QCL = Qex⋅Dlum в таких реакциях, как цепноеокисление органических молекул (включая, по-видимому, перекисноеокисление липидов) имеет порядок величины QCL = 10–4⋅10–4 = 10–8,т.е.
очень мал (сверхслабое свечение) [11]. Причина низкого выхода образования возбужденных молекулпродукта в ХЛ-реакции становится ясной из рассмотрения схемыизлучательных и безызлучательных электронных переходов в молекуле ароматической аминокислоты при простейшей ХЛ-реакции:рекомбинации катион-радикала AH+ и сольватированного электронаe–, образующихся при фотоионизации ароматичеких аминокислот поддействием УФ-облучения. Приведенная на рис. 3 схема электронныхпереходов, построенная на основании исследований термо- и фото350Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаРис. 3.
Схема электронных уровней и электронных переходов в ароматическихаминокислотах, облученных при 77 К УФ-радиацией. S0 – аминокислота в основном состоянии; S1 – в возбужденном синглетномсостоянии; T1– в триплетном состоянии; e¯ – сольватированный электрон, появляющийся при фотоионизации аминокислоты при УФ-облучении. Электронныепереходы e¯ → S1 → S0 и e¯ → T1→ S0 сопровождаются высвечиванием фотона.Прямой переход e¯ → S0 свечением не сопровождается. Отношение вероятностиизлучательных переходов к вероятности перехода безызлучательного равноквантовому выходу (хеми)люминесценции.
Разница уровней e¯ и T1 (или S1)равна энергии активации люминесценции при рекомбинации сольватированногоэлектрона и катион-радикала. Видно, что энергия активации для излученияфотона с триплетного состояния (Т1) существенно ниже энергии активациидля излучения при переходе через синглетное возбужденное состояние. Поэтой причине вероятность излучательного перехода, т.е. квантовый выход хемилюминесценции, через триптлетное состояние примерно в 100 000 раз выше,чем при переходе через синглетное состояние. Эта схема показывает также, чтоэнергия фотона равна сумме энергии активации и теплоты реакции рекомбинации сольватированного электрона и катион-радикала (т.е. реакции переходаe¯ → S0 ). Подробнее см. [11], стр. 54–62.индуцированной люминесценции УФ-облученных образцов [11],позволяет объяснить основные закономерности, типичные дляреакций ХЛ: низкий квантовый выход ХЛ, суммирование тепловойэнергии хемилюминесцентной реакции и энергии активации свечения (правило Одюбера) и то обстоятельство, что в большинствеХЛ‑реакций спектр ХЛ совпадает со спектром фосфоресценции, а нефлуоресценции продукта реакции [56] (подробнее см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
