Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина - Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция (1123292), страница 5
Текст из файла (страница 5)
В наших исследованиях ЛХЛ использовалась для определенияпероксидазной активности комплексов цитохрома c с кардиолипином.Была показана зависимость активности комплексов от содержаниякардиолипина [59, 61, 62, 108], присутствия антиоксидантов [109,110] и монооксида азота и восстановление активности комплексов,ингибированных NO, при действия лазерного облучения [111].Хемилюминесценция люминолав присутствии гипохлоритаГипохлорит – природное соединение, образуемое в реакции, катализируемой ферментом миелопероксидазой (МПО):МПО H2O2 + CL¯ → H2O + ClO¯.
Этот процесс происходит при контакте гранулоцитов крови счужеродными клетками, например, бактериями. Активация рецепторов на поверхности клеток запускает процесс сборки элементовНАДФН-оксидазного комплекса и усиленное образование НАДФНв клетках, а затем к дыхательному взрыву, т.е. резкому потреблениюкислорода и образованию супероксидного радикала [20, 21, 95]:НАДФ+ + 2·OO¯ + H+. НАДФН + 2O2 В присутствии супероксиддисмутазы (СОД) супероксид превращается в H2O2, которая и служит субстратом МПО.Гипохлорит окисляет люминол (LH2), возможно через стадию егохлорпроизводного (LHCl) [97], до аминобензодиазахинона (ABDC)(рис.
6): LH2 + HOCl → H2O + LHCl → HCl + L (ABDC). В присутствии H2O2 может образоваться гидропероксид люминола – ключевое звено ХЛ-реакции [97]: L + H2O2 → LHOOH. В биологических системах гипохлорит образуется в реакции сучастием H2O2, и таким образом, его появление обязательно привоСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция361Рис. 6. Окисление люминола гипохлоритом (объяснение в тексте).дит к ХЛ, интенсивность которой, однако, будет уменьшаться как вприсутствии веществ, реагирующих с гипохлоритом (например, соединений, содержащих аминогруппу), так и под действием каталазы(удаляющей H2O2).Таким образом, между «гипохлоритным» и «радикальным»путями инициирования люминол-зависимой ХЛ имеется важноеразличие: для формирования ключевого соединения – гидропероксида люминола – в первом случае нужен H2O2 (не ингибируемая СОД,каталаза-чувствительная ЛХЛ), а во втором – супероксидный радикал(ингибируемая СОД, или СОД-чувствительная, каталаза-нечувствительная ЛХЛ). Применить на практике эти критерии непросто,т.к., например, удаление H2O2 каталазой может иметь следствиемпрекращение образования радикалов, запускающих реакцию слюминолом, и тогда этот путь ХЛ тоже окажется чувствительным кдействию каталазы.
Известная независимость двух путей окисления люминола подтверждается данными о действии различных биохимических веществна ХЛ, наблюдаемую в модельной системе, содержащей люминол игипохлорит [112]. Было показало, что наибольшей ингибирующейактивностью обладали тиоловые соединения: тиомочевина > цистеин >сывороточный альбумин человека > восстановленный глутатион> N-ацетил-L-цистеин (половинное угнетение в концентрациях1,2 ×10–7–8,5×10–7 моль/л.
Существенно менее активными были ами362Ю.А.Владимиров, Е.В.Проскурнинанокислоты и окисленный глутатион, т.е. соединения, содержащиеаминогруппы (2,5 ×10–6–3,2 ×10–5 моль/л). Метионин, аскорбат, таурини десферал обладали промежуточной активностью (1,1 ×10–6–5,3 ×10–5моль/л) [112]. Этот порядок активностей соответствует способностиперечисленных соединений связывать гипохлорит (концентрациякоторого в опытах составляла 2,5×10–6 моль/л). С другой стороны,в цитированной и других работах было показано, что перехватчикисинглетного кислорода, гидроксильного и органических радикалов,такие как маннитол, глюкоза и диметилмочевина практически невлияли на ЛХЛ, вызванную гипохлоритом. Это подтверждает тот факт,что «гипохлоритный путь» ХЛ-реакции люминола не требует участиярадикалов. С другой стороны, весьма эффективным ингибиторомЛХЛ в данной системе была каталаза [112]. В другой работе тойже группы авторов было показано, что в системе, содержащей гипохлорит (10–6 моль/л) и люминол (5×10–5 моль/л), интенсивность ХЛбыла прямо пропорциональна количеству H2O2, добавленной в концентрациях от 3×10–9 до 3×10–6 моль/л [113].Относительный вклад двух путей окисления люминолав клеточную хемилюминесценциюВопрос об относительной роли двух механизмов ЛХЛ не прост, т.к.вклад каждого механизма зависит от концентраций всех участниковпроцесса: супероксида, H2O2, радикалов гидроксила и других соединений, металлов переменной валентности, соединений, реагирующихс гипохлоритом и антиоксидантов, а также от активности пероксидазв исследуемой биологической системе.
Один из наиболее часто исследуемых объектов – полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ). Изучение физико-химических основусиленной люминолом ХЛ стимулированных (активированных)ПМЯЛ проводилось в работе Д.И.Рощупкина и соавторов [97]. Вчастности, при исследовании природы первичного окислителя люминола было показано, что активированная 20 мкМ люминолом ХЛлейкоцитов, стимулированных форболмиристатацетатом (ФМА),не изменяется в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО) вконцентрациях 0,02–2,6 мМ, при которых он должен проявлять специфическую способность перехватывать гидроксильные радикалы.
Этосвидетельствует о том, что при стимуляции полиморфноядерныхлейкоцитов не происходит генерация гидроксильных радикаловс участием супероксид-аниона и гипохлорита, синтезируемогомиелопероксидазой. При высоких концентрациях ДМСО (260 мМ)наблюдалось значительное ослабление ХЛ, обусловленное прямойСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция363реакцией ДМСО с гипохлоритом.
С другой стороны, экзогенныеаминокислоты и таурин в значительных концентрациях (3–15 мМ)ослабляли ХЛ. Был сделан вывод, что в исследованной системе ХЛв основном обусловлена начальной реакцией гипохлорита с люминолом; интенсивность свечения увеличивается в результате окисленияH2O2 продуктов превращения люминола. Любопытно, что не только гипохлорит, но и хлорамины, например,такие как N-хлорфенилаланин, вызывают ХЛ люминола в присутствии H2O2 [114]. Это говорит о том, что начальную стадию окислениялюминола по механизму двухэлектронного окисления (см. схему нарис.
6) может осуществлять не только гипохлорит, но и хлорамины,которые образуются в живых системах при появлении гипохлорита.При добавлении в ПМЯЛ хлорамины вызывали вспышку свечениянестимулированных клеток (там же).Внутри- и внеклеточные пулы АФКСчитается, что при активации клеток (т.е. в результате действия тогоили иного стимула) образование АФК имеет место как внутри, так ивне клетки. Признаться, доказать это методами ХЛ нелегко, если АФКпроникает через клеточные мембраны и таким образом перераспределяется между внутри- и внеклеточным пулами в ходе измерения ХЛ.В сущности, мы можем измерять стационарные концентрации АФК, ане место их возникновения. С этой оговоркой следует остановиться наработе [115], где исследовалось действие нескольких SH-соединений,которые, как известно, активно перехватывают АФК и гипохлорит[112], на хемилюминесценцию ПМЯЛ, усиленную люминолом.
Былопоказано, что источником примерно половины свечения являются самиклетки, и это свечение тушат проникающие сульфгидрильные соединения, такие как дитиотреитол и N-ацетилцистеин. Другая половинасвечения люминола полностью подавляется непроникающим восстановленным глутатионом. Этот подход представляется нам весьмаперспективным в подобных исследованиях.ЛХЛ как метод определения активностимиелопероксидазыС точки зрения применимости метода ЛХЛ особое место среди пероксидаз занимает миелопероксидаза, при работе которой люминолподвергается химической атаке не столько самим ферментом, сколькоего субстратом – гипохлоритом. Миелопероксидаза – это гемсодержащий фермент, выбрасываемый стимулированными гранулоцитамикрови в зонах воспаления.
Генерируемый этим ферментом гипохлорит364Ю.А.Владимиров, Е.В.Проскурнинапризван разрушать стенки бактерий, но одновременно может повредить и собственные ткани. В обзоре [116] рассмотрены свойства имеханизм работы этого фермента, а также методы ХЛ, используемыедля определения его активности. В 1999 г. был предложен метод специфического анализа МПО полюминол-зависимой ХЛ в присутствии бромида [117].
В присутствии0,1мM люминола, 10 мM H2O2, 10 мM DTPA (диэтилентриаминпентаацетат) наблюдалась ХЛ в среде, содержащей экстракт нейтрофилов,а также 5 мМ KBr; свечение отсутствовало в среде с KCl. Метод,разработанный авторами, позволял обнаруживать МПО при содержании в образце больше 100 клеток нейтрофилов и был специфичен,т.к. присутствие других пероксидаз и гемопротеинов не влияло нарезультаты анализа.IV.
Люцигенин-зависимая ХЛ клетокЛюцигенин как метод количественного определениясупероксидных радикаловОбнаружение супероксидного радикала в живых клетках – чрезвычайно важно из-за ведущей роли этого радикала в редокс-сигнализации внутри клетки и в развитии большого числа патологическихсостояний. В силу высокой чувствительности люцигенина в качествеХЛ-зонда на супероксидный радикал [118], люцигенин-активируемаяХЛ (Люц-ХЛ) использовалась для обнаружения ⋅OO¯ при окисленииксантина или гипоксантина ксантиноксидазой [119], НАДФНцитохром редуктазой микросом[119], НАДФН-оксидазой клетокфагоцитов [120, 121], и чувствительными к дифенилениодониумуНАДФН-оксидазами клеток эндотелия, фибробластов [122] и гладкомышечных клеток стенок кровеносных сосудов [123, 124].
Было такжепредложено использовать Люц-ХЛ для изучения образования ⋅OO¯митохондриями в интактных клетках [125, 126]. Такая популярностьметода понятна: количество биологического материала, необходимогодля того, чтобы сигнал, вызванный ·OO¯, превышал фон в 10 разпри использовании Люц-ХЛ было в 3750 раз меньше, чем прииспользовании предложенного Фридовичем метода, основанногона восстановлении супероксидом ацетилированного цитохрома с(Fe3+) [119].
Однако, в 1993 г. Фолкнер и Фридович [127], а затем в 1997 г.Лёчев и Фридович [128] высказали сомнение в возможности использовать люцигенин в качестве адекватного метода определения ⋅OO¯на том основании, что в определенных условиях люцигенин можетСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция365Рис. 7. Хемилюминесцентная реакция люцигенина (взято из [129] с небольшимиизменениями).сам быть источником супероксидных радикалов в реакции егоодноэлектронного окисления кислородом воздуха.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
