Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина - Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция (1123292), страница 3
Текст из файла (страница 3)
в [11] и [49]).собственная хемилюминесценцияпри перекисном окислении липидовОбразование возбужденного состояния при взаимодействии свободных радикалов в самом общем виде может быть описано уравнениемреакции:kеR1· + R2· → P* → P + фотон.Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция351 Однако в разных случаях процесс различается в деталях. Наиболеераспространенная реакция, сопровождающаяся ХЛ в клетках и тканяхживотных и человека, это реакция перекисного окисления липидов(ПОЛ), которая представляет собой частный случай реакций цепногоокисления органических соединений молекулярным кислородом.Цепное окисление представляет собой реакцию, субстратами которой служат полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), входящие в состав липидов биологических мембран и липопротеинов(обозначим молекулу LH), и молекулярный кислород, а продуктом –гидропероксиды ПНЖК (LOOH).
Реакция начинается при появлениив среде активного радикала X·, которым может быть липидныйрадикал, т.е. радикал ПНЖК, такой как алкил L·, алкоксил LO· илидиоксил (пероксил) LOO·, другие органические радикалы и радикалгидроксила HO·:kkkk3122→ L1· → L1OO· → L2· →X· + L1H − XH+O+L H, − L OOH+O2212k2+ O2→ L2OO·… и т.д. Продукты цепного окисления, гидропероксиды липидов LOOH,могут стать источником новых радикалов, а следовательно – источником новых цепей окисления, при реакции одноэлектронноговосстановления, например, в присутствии ионов Fe2+ [33, 57, 58], либопри пероксидазной реакции, катализируемой гемовыми белками, втом числе цитохромом с, связанным с кислыми фосфолипидами наповерхности внутренней мембраны митохондрий [59–62]: При этом происходит разветвление цепи окисления и скоростьПОЛ в системе резко возрастает.
В этих реакциях возбужденные молекулы образуются при взаимодействии двух пероксидных радикалов. В специальных опытах срастворами, не содержащими кислорода, было показано, что образование одних только радикалов L·и LO· недостаточно для возникновения ХЛ, нужны радикалы LOO·, которые образуются в присутствиикислорода [63]. Наиболее вероятно, что ХЛ при липопероксидациисвязана с диспропорционированием радикалов LOO·:k6 LOO· + LOO· → LOH + L=O* → L=O + фотон.Здесь k6 – константа скорости реакции. Этот механизм был доказан в реакциях цепного окисленияуглеводородов, также сопровождающихся ХЛ (библиографию см.
в[11]). По-видимому, сначала образуется тетроксид:352Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаR12 R2OOR1 OOOOR2R1 .R2 Затем происходит связанное с развитием механического напряжения в скелете молекулы образование спирта и бирадикала:R2R1 OOOOR1R1 OOOOR2R 1.R2H R2 Эту стадию мы можем рассматривать как момент разделенияэлектронов в молекуле. Как и в случае фотоионизации, рассмотреннойвыше, образованию возбужденной молекулы продукта предшествуетразделение электронов, но в данном случае это внутримолекулярный,а не межмолекулярный процесс.
Последующая химическая стадияприводит к выделению молекулы кислорода и образованию кетонав триплетном возбужденном состоянии [64–66]:R1 OR2OOOO+R1R2CR1O*R2CO*+h ν. Выход образования возбужденных молекул кетона, как и квантовый выход его люминесценции (фосфоресценции в данном случае),очень малы, благодаря чему общий квантовый выход ХЛ тожевесьма низок (порядка 10–8). В работе [66] рассмотрен детальныймеханизм образования возбужденной молекулы формальдегида притермическом разложении диоксетана как примера простейшей реакции ХЛ подобного типа. Регистрация ХЛ при цепном окислении позволяет измерятькинетику изменения стационарной концентрации свободных радикалов в системе во времени, а вместе с тем – измерять скорость реакции ПОЛ в каждый данный момент времени.
Найдем связь междуконцентрацией радикалов LOO· и интенсивностью свечения ICL. Онаследует из уравнения реакции (см. выше): ICL=QCLk6[LOO·]2.(5) Здесь ICL – общий световой поток ХЛ во всех направлениях и привсех длинах волн, Эйнштейн/с; QCL – квантовый выход ХЛ. Скорость процесса пероксидного окисления – это скоростьобразования продуктов окисления гидропероксидов в реакции:Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция353k2 LOO· + LH → L· + LOOH,где k2 – константа скорости этой реакции.(6) d[LOOH]/dt = k2[RH][LOO·] = k2[RH] I CL /(QCL k6 ) . Следовательно, скорость пероксидного окисления пропорциональна стационарной концентрации свободных радикалов в системе исвязана с интенсивностью ХЛ уравнением (6).
Поэтому, регистрируяинтенсивность ХЛ, можно следить за изменениями во временискорости пероксидного окисления липидов, т.е. изучать кинетикуэтого процесса, а тем самым и его механизм [33, 58, 67, 68]. Сочетаниеанализа кинетики с математическим моделированием процессапозволило, кроме того, исследовать этим методом активность исодержание антиоксидантов в исследуемых системах [23, 69–76].Кинетика железо-индуцированной хемилюминесценцииОписанный выше параллелизм между интенсивностью собственнойХЛ, сопровождающей цепное окисление липидов, и скоростьюцепного окисления четко проявляется при изучении довольносложной кинетики ХЛ в липид-содержащих системах, включаялипосомы и митохондрии, к суспензии которых добавлено некотороеколичество солей Fe2+. Типичная кинетика ХЛ при реакции цепногоокисления липидов, инициированной добавлением к исследуемойсистеме солей двухвалентного делеза, показана на рис.
4 и включаетв себя ряд последовательных стадий [77, 78]. Непосредственнопосле добавления ионов Fe2+ наблюдается быстрая вспышка свечения, связанная с разложением гидропероксидов липидов, если онисодержались в объектах, которая сменяется фазой угнетения свечения.Эта стадия обусловлена антиоксидантными свойствами Fe2+ при егодостаточно высоких концентрациях (порядка 50 мкМ в суспензияхмитохондрий и липосом). При снижении концентрации Fe2+ нижеэтого критического значения ионы Fe2+ начинают работать какпрооксиданты за счет реакции разветвления цепей, в результате чегоразвивается так называемая медленная вспышка свечения. Она затухает после полного окисления Fe2+ до Fe3+. Однако процесс на этом незаканчивается, т.к.
вслед за этим в суспензии липосом, митохондрийи в плазме крови постепенно развивается так называемое стационарное свечение (см. рис. 4) [57]. Исследование кинетики такой ХЛ в сочетании с определениемокисления Fe2+, потребления кислорода и математическим моделированием реакций [79] позволило расшифровать систему уравнений354Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаРис.4. Кинетика окисления ионов Fe2+ (сплошная линия), образования продуктов перекисного окисления липидов (реактивные продукты тиобарбитуровойкислоты, ТБКРП) (точечная линия) и хемилюминесценции (пунктирная линия)в суспензии митохондрий, к которой добавлены 0,2 мМ Fe2+ (момент введенияпоказан стрелкой) [57].
Состав инкубационной смеси: 1 мл суспензии митохондрий в 10 мл 105 мМNaCl и 20 мМ трис-буфера, pH 7,5; t =20ºC. ЛП – латентный период, БВ – быстрая вспышка, МВ – медленная вспышка, СС – стационарное свечение.разветвленного цепного окисления липидов, определить константыскоростей основных реакций, а также изучить механизм действия иактивность различных антиоксидантов, как природных [74, 80–82],так и синтетических [71]. Эти результаты подробно рассмотрены вобзорах [33, 47, 48, 58, 67, 68, 76] и здесь мы не будем на них останавливаться.Собственная хемилюминесценция(сверхслабое свечение) тканей и клетокКак уже говорилось, сверхслабое свечение клеток и ткани быловпервые описано в 1959–1961 гг. [7, 8, 11]. В 1964–1966 гг.
была проведена серия исследований по СХЛмитохондрий, гомогенатов и кашиц печени крысы, в которых былавыявлена четкая корреляция между уровнем собственного свеченияи накоплением продуктов липидной пероксидации, реагирующих с2-тиобарбитуровой кислотой [10, 12, 83–85]. Было показано также,что присутствие примесей ионов железа резко стимулирует свечениеСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция355и липопероксидацию, тогда как комплексон ЭДТА полностью ихснимает.
В то же время была выявлена связь между метаболизмом иСХЛ: последнее угнеталось амиталом и цианидом. Все эти данные,обобщенные в монографии 1972 г. [33], говорили о том, что свечениесвязано с липидной пероксидацией в клетках и изолированныхмитохондриях и что решающую роль в активации этого процессаиграют ионы Fe2+ (см. также [57]). Однако, цепное окисление липидов – не единственная возможнаяпричина собственной ХЛ клеток и тканей животных. В большойсерии работ было показано, что реакции с участием радикаловкислорода также сопровождаются ХЛ, возможно, в результатеобразования синглетного кислорода (см. библиографию в [11]). Ноинтенсивность этого свечения обычно много ниже, чем при реакциях липопероксидации.
Еще одна составляющая «сверхслабогосвечения» клеток и тканей была описана в опытах группы Тёрренсана перфузируемом легком и в модельных системах [53, 86], связаннаяс биосинтезом NO. С другой стороны, в работе [87] было показано,что при взаимодействии белка с пероксинитритом наблюдается ХЛ.При действии пероксинитрита на индивидуальные аминокислотынаиболее интенсивная ХЛ была получена с триптофаном, несколькоменьшая – с фенилаланином [86]. Можно думать, что при окислениитриптофана имеет место образование возбужденных молекул.
Вопытах на перфузируемом легком NO-зависимая СХЛ наблюдаласьв норме, тогда как при воспалительных процессах в легком основной составляющей становилась ХЛ, связанная с липидной пероксидацией [88]. В 1972 г. было обнаружено собственное свечение стимулированных фагоцитов [15, 16]. Динамика развития ХЛ в суспензии макрофагов показана на рис. 2б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
