Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурина - Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция (1123292), страница 8
Текст из файла (страница 8)
C-525,как показывают, является более эффективным активатором ХЛ, чемранее известный хлорофилл а [149]. При этом активация имела местотолько в системах пероксидации, где образуются карбонильные продукты в электронно-возбужденном состоянии, и не наблюдалась приработе пероксидазы хрена. В работе [150] сравнивали активированную С-525 ХЛ при добавлении ионов Fe2+ к липопротеинам низкой плотности (ЛПНП), окисленным разными методами и в разной степени. Была обнаруженахорошая корреляция (0,97–0,98) между амплитудой быстрой вспышкии количеством гидропероксидов, определенных методом регистрациисопряженных двойных связей (диеновой конъюгации). Сама по себеамплитуда ХЛ в присутствии С-525 была более чем на два порядкавыше, чем без активатора. Детальное исследование активации ХЛ при липидной пероксидации липопротеинов (ЛП) крови было проведено также в работе [151].Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция375Рис. 10. Хинолизиновые кумарины — физические активаторы ХЛ [148].В концентрации 4 мкМ C-525 усиливал вспышку ХЛ при добавленииионов Fe2+ к окисленным ЛПНП в 2000 раз.
Измерения флуоресценции показали, что краситель находился в гидрофобной фазе ЛП, итаким образом реальная концентрация активатора была достаточновысокой для эффективного переноса энергии с возбужденных молекулкарбонильных продуктов липопероксидации. В работе [148] было показано, что окрашивание клеток в культурекумариновыми красителями C-525 и C-334 позволяет обнаружитьХЛ в этих клетках, вызванную инициатором свободнорадикальногоокисления AMVN [2,2'-азобис (2,4-диметилвалеронитрил)]. При этомни жизнеспособность клеток, ни содержание в цитоплазме восстановленного глутатиона не изменялись, а добавленный краситель неподвергался химической деградации.
Влияния на уровень липиднойпероксидации С-525 в используемых концентрациях тоже не оказывал. Свечение наблюдалось также при пероксидации, вызваннойгидропероксидами трет-бутила и кумола (изопропилбензола). Однако попытка усилить ХЛ путем введения С-525 при пероксидации плазмы крови не привела к успеху. Это объясняется связываниемгидрофобного С-525 белками плазмы, прежде всего – сывороточнымальбумином. В самое последнее время ХЛ в присутствии С-525 была использована в нашей группе для изучения образования липидных радикаловпри окислении природного кардиолипина (содержащего полиненасыщенные жирные кислоты), катализируемом комплексом кардиолипина с цитохромом c [109, 110].
При этом удалось установить, чтосамо по себе образование комплекса цитохрома c с кардиолипином и376Ю.А.Владимиров, Е.В.Проскурнинадругими анионными липидами придает этому гемопротеину свойствапероксидазы [59–62]. В присутствии природного кардиолипинапроисходит образование радикалов липидов, которое проявляетсяв Кум-ХЛ. Этот процесс может идти в отсутствии H2O2, если система содержала другие гидропероксиды, включая пероксиды кардиолипина, но дополнительное введение H2O2 ускоряло реакциюпероксидации.
Антиоксиданты тормозили появление как радикаловлюминола в пероксидазной системе цитохром с + кардиолипин, таки образование радикалов липидов. Поскольку пероксидация кардиолипина может рассматриваться как ключевая стадия в запуске апоптоза [152], эти данные могут быть использованы при разработкеметодов регуляции апоптоза медикаментозными средствами.VII. применение клеточной ХЛ в медицинеВ патогенезе многих болезней и патологических процессов играетважную роль оксидативный стресс [153]. Метод ХЛ оказывается полезным при изучении таких патологий, поскольку дает возможностьизмерять уровень свободных радикалов (АФК, NO), оценивать параметры антиоксидантной защиты и влияние антиоксидантов. Хемилюминесценцию успешно применяют при изучении иммунных нарушений, нарушений метаболизма, дисфункции эндотелия, ишемии/реперфузии миокарда и мозга, онкологических и воспалительныхзаболеваний, а также многих других болезней, патогенез которыхсвязан с оксидативным стрессом.Ишемическое повреждение миокарда и мозгаПовреждение клеток при реперфузии ишемизированной тканиопосредовано множеством факторов, ключевым из которых являютсясвободнорадикальные механизмы: восстановление кровотока резкоусиливает оксидантные процессы при сниженной активности антиоксидантной системы.
Особую опасность оксидативный стресспредставляет для интенсивно потребляющих кислород клеток – кардимиоцитов и нервных клеток [154–156]. Возможными источникамиАФК являются полиморфноядерные лейкоциты, ксантиноксидазнаясистема, митохондрии, метаболизм арахидоновой кислоты и др.Усилению повреждающего действия АФК способствует снижениепродукции NO вследствие дисфункции эндотелия и его инактивациейсупероксидом. Роль АФК и состояние антиоксидантных ферментовпри ишемии/реперфузии миокарда оценивали методом ХЛ в работах[157–166], в том числе при ангиопластике [167–170]. Продукцию NOСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция377измеряли методом озоновой ХЛ [171, 172] в виде продуктов окисления (нитрит и нитрат) [173]. В исследованиях ишемии головного мозга измеряли ХЛ плазмыкрови, изолированных фагоцитов, гомогенатов ткани мозга приишемии и последующей реоксигенации, оценивая уровень АФК,образуемого фагоцитами, влияние длительности ишемии на степеньповреждения и роль антиоксидантов [174–177].Дисфункция эндотелияЭндотелий сосудов в норме выполняет множество метаболических исигнальных функций, регулируя, в частности, процессы вазодилатациии вазоконстрикции.
Положение эндотелия на границе между кровьюи тканями делает его наиболее уязвимым для действия свободныхрадикалов, которые приводят к повреждению клеток и к состояниюдисфункции эндотелия и развитию ангиопатий, атеросклероза и пр.[178]. Метод ХЛ позволяет оценивать генерацию супероксидногорадикала и NO собственно эндотелием, а также влияние активныхформ кислорода нейтрофилов на состояние сосудов. В основномопределяют уровень супероксида по люцигениновой ХЛ и, реже,уровень NO [143]. В качестве объектов используют изолированныесосуды и гомогенаты тканей человека [143] и животных [179–181],культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека [182, 183]и коронарных микрососудов [184]. Влияние острого воспаления наэндотелий сосудов изучали авторы [183, 185].
Роль оксидативногостресса в патогенезе атеросклероза показана в также работах [186–188].Заболевания центральной нервной системыИсследования последних лет доказали участие АФК и других свободных радикалов в патогенезе различных болезней центральнойнервной системы [189, 190] хотя пока неясно, являются ли онипричиной или сопутствующим явлением этих патологическихпроцессов. Особенно важную роль оксидативный стресс играетв развитии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезньАльцгеймера [191–193],повреждении мозга при эпилептическихприступах [140, 194].
Метод ХЛ использовали для измерения уровняАФК, продуцируемых нейтрофилами крови, или непосредственноХЛ гомогенатов ткани мозга, а также оценивали состояние антиоксидантных систем ( Cu–Zn СОД, каталазы, системы глутатиона,общей антиоксидантной емкости крови и т.д.) [195, 196].378Ю.А.Владимиров, Е.В.ПроскурнинаРевматоидный артритРевматоидный артрит – системное хроническое воспалительноезаболевание иммунного генеза, при котором длительное воспалениеприводит к постоянной активности нейтрофилов и повреждениютканей вырабатываемыми ими АФК. В базе данных PubMed процитировано более 150 работ, касающихся этой темы, в которых изучаютпродукцию АФК, прежде всего супероксидного радикала, измеряя ХЛизолированных нейтрофилов периферической крови и синовиальнойжидкости больных [197–201], ХЛ-отклик нейтрофилов доноровпосле инкубации с сывороткой крови и синовиальной жидкостьюбольных [201–206], ХЛ изолированных моноцитов крови [207],изолированных митохондрий [208] и культуры фибробластов [209].Изучено влияние на ХЛ нейтрофилов некоторых медиаторов ивеществ, в частности, гидроксиапатита [210, 211], фосфолипазыА2 [212], фактора активации тромбоцитов [213], кислорода [214],вещества Р [215] и др.
По интенсивности ХЛ полиморфноядерныхлейкоцитов оценивали развитие болезни [216], эффективностьлечения [217, 218].Онкологические заболеванияПолагают, что онкологические заболевания являются результатом нарушения функционирования определенных генов. С этой точки зрениякаждый фактор, взаимодействующий с ДНК и модифицирующийее, является канцерогеном. АФК, такие как гидроксильный радикал,способны напрямую повреждать митохондриальную и ядерную ДНКи, следовательно, обладают мутагенным, канцерогенным действием[219].
Роль свободных радикалов кислорода и азота не ограничиваетсяпрямым повреждением ДНК – они могут нарушать процессы апоптоза,редокс-баланс, регуляцию путей клеточного сигналинга и др. [220].Хемилюминесцентный метод использовали для оценки влиянияхимиотерапии на пролиферацию и активацию клеток опухоли [221],для изучения параметров прооксидантной и оксидантной активностизлокачественных опухолей по сравнению с доброкачественными [222,223], исследования механизмов метастазирования [224].VIII. ЗаключениеСвободные радикалы – важные участники регуляторных процессов вживых клетках, но одновременно – причина повреждения клеточныхструктур и триггер, запускающий каскад реакций самоуничтоженияСвободные радикалы и клеточная хемилюминесценция379клеток – апоптоза.
Их ведущая роль в развитии практически всехболезней пожилого возраста и старении организма общепризнаннаи является объектом многочисленных исследований. Однако средняяпо времени (стационарная) концентрация этих активных частиц вживой клетке очень мала, и их прямое обнаружение обычными биохимическими методами практически невозможно. Метод хемилюминесценции основан не на анализе веществ, а на измерении скоростиреакций, сопровождающихся свечением, а именно такие реакциихарактерны для свободных радикалов.
Наиболее известные хемилюминесцентные реакции в биохимических системах – собственное (сверхслабое) свечение при цепномокислении липидов, реакции люминола с АФК (гидроксильнымрадикалом и супероксидом) и органическими радикалами, реакциилюцигенина и ряда производных люциферинов с супероксиднымрадикалом, – все они включают в себя на определенном этапе взаимодействие двух радикалов, которое позволяет образовавшейся молекуленакопить такое количество энергии, что его оказывается достаточнымдля излучения фотона конечным продуктом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
