obshaya_tsitologia (1120994), страница 40
Текст из файла (страница 40)
для белков ядерной локализации, которыесинтезируются на рибосомах в цитоплазме, а затем транспортируются вядро.Импорт кариофильных белковВпервые аминокислотные последовательности ядерной локализации былиобнаружены на С-конце субъединиц молекулы нуклеоплазмина (ядерныйбелок,принимающийучастиевструктуризациихроматина).Этиэксперименты были проведены на бесклеточной системе, когда выделенныеядра помещались в цитоплазматический экстракт ооцитов ксенопуса, кудадобавляли нативные или измененные молекулы нуклеоплазмина. Этокрупный белок (125 кД), состоящий из пяти субъединиц, каждая из которых206обладает глобулярной и фибриллярной, С-концевой, частями. Если удалитпутем протеолиза примерно 50 аминокислот с С-конца, то ни пентамер, нимономеры в ядро не попадают, в то время как отщепленные фибриллярныеучастки через поры проходят свободно, так как содержат NLS-участок.Более того, при смешивании неядерных белков с этими NLS-фрагментами,такие комплексы способны транспортироваться в ядро.
Даже крупныечастицы декстрана (20 нм), неспособные проникать в ядро, при связывании сними NLS-последовательностей нуклеоплазмина транспортировались изцитоплазматического экстракта в ядро.Подробно строение NLS изучено у белка Т антигена вируса SV40.Кариофильный сигнал состоял из последовательности: Pro-Lys-128Lys-LysArg-Lys-Val. Одна лишь аминокислотная замена (128Lys на Thr или Asp)полностью лишают этого фрагмента кариофильных свойств.
Оказалось. чтоможно создавать химерные белки с этим аминокислотным доменом, чтопозволяет необычные для ядер белки (альбумин плазмы, иммуноглобулин G,и даже ферритин с мол. массой 465 кД) транспортировать через ядерныепоры.Было показано, что белок с NLS проходит в ядро через несколько этапов(рис. 111). Импорт начинается с того, что NLS-белок связывается сгетеродимеромрецепторалокализованнымивNLS,цитоплазме.сбелкамиимпортинамиВозникшийбелковыйαиβ,комплекс(импортируемый белок с NLS, связанный с импортинами α и β) подходит квнешней ядерной мембране и закрепляется на цитоплазматическихфиламентах порового комплекса.
Затем этот комплекс входит в ядернуюпору и проходит через “транспортер”. Считается, что транспортер состоит измножества извитых белковых филаментов, обогащенных аланином иглицином (FG-филаменты), представляющих собой барьер для транспортанекариофильных белков. Комплекс же, имеющий NLS как бы разрыхляет этусеть и проходит через канал транспортера.
После перехода комплекса в207нуклеоплазму импортин β связывается с белком RAN, представляющегособой малую GTP-азу, что приводит к распаду комплекса. Импортируемыйбелок освобождается и остается в ядре, импортин α возвращается вцитоплазму, так же как и импортин β, но в связи с RAN-GDP, где последниетакже диссоциируют. Тем самым только белок с NLS остается в составе ядра(рис. 111).Экспорт из ядра в цитоплазмуИз ядра в цитоплазму также существует поток как белков, так и ядерныхтранскриптов в виде рибонуклеопротеидов. В принципе этот экспорт своейорганизации сходен с процессом импорта кариофильных белков. Так былообнаружено, что гликопротеидные молекулы, связывающие лиганды,локализуются в место поровых комплексов и со стороны ядра.
Одна и та жепора может принимать участие как в импорте, так и в экспортемакромолекул. В пользу этого говорит то, что частички коллоидного золота,связанного с нуклеоплазмином, сорбируются на ядерной поре со стороныцитоплазмы, одновременно с сорбцией частичек, связанных с РНК,инъецированных в ядре ооцитов. Подобные эксперименты показали, чтомногие РНК (тРНК, 5S РНК, поли-У и поли-А), связанные с коллоиднымзолотом, аккумулируются в зоне ядерных пор, а затем переносятся вцитоплазму. Более того, РНК способствует переносу через ядерную порукрупных частиц золота размером до 20 нм.
Обратного переноса непроисходит: аналогичные частички, инъецированные в цитоплазму ооцита, вядро не проникают.Что касается естественных видов РНП, то комплексы ядерных пор такжедолжны узнавать специфический сигнал на экспорт. Белковые компонентыРНП несут аминокислотные последовательности, сигналы ядерного экспорта(NES), которые дают возможность различным РНП проходить через ядернуюоболочку в цитоплазму.208В этом случае также образуется сложный комплекс, состоящий изпереносимого белка с NES-последовательностью (связанного с РНК илисвободного), ассоциированного с белком экспортином 1, который в своюочередь связан с RAN-GTP. Этот комплекс проходит через центральныйканал, создаваемый транспортером, в цитоплазму, где и диссоциирует.
Приэтом освобождается белок с NES-участком (или РНП), который остается вцитоплазме. Экспортин 1 и RAN после гидролиза GTP снова возвращаются вядро (рис. 112).В процессе экспорта РНП ядерная пора контролирует не только белковыйкомпонент. Ядерные поры узнают и не экспортируют короткие (100нуклеотидов) тРНК, если в их структуре есть хоть одна замена. Транспортнезрелых форм иРНК, имеющих интронные участки, не происходит. Вообщев цитоплазме не обнаруживаются незрелые РНК. Вероятно, для экспортанекоторых РНК необходима их связь с особыми белками. Так 5S РНКпереносится в цитоплазму вместе с транскрипционным фактором TFIIIA,или с белком L5.
Мутантные формы 5S рРНК, которые не связываются сTFIIIA, остаются в ядре.Мало изучен вопрос о транспорте в цитоплазму крупных РНПкомплексов, таких как субъединицы рибосом, информосомы и малыеядерные РНП. Возможно все они под действием каких-то факторовразворачиваются, меняют свою конформацию и проходят через поровыйкомплекс.
В пользу этого говорят наблюдения гантелевидных РНКсодержащих частиц, в просвете пор ядер гигантских слюнных железнасекомых. Считается, что эта картина отражает момент выхода из ядерРНП-частиц 60 нм в диаметре, относимых к информоферам. Интересно, чтосостав белков в цитоплазматических информационных РНП иной, это можетговорить о том, что в зоне поровых комплексов происходит “переодевание”информационных РНК, связь их с иными белками.Динамика ядерной оболочки в митозе209Большей частью, но не у всех видов (исключение составляют амебы,эвгленовые, инфузории, динофлагелляты, многие водоросли, некоторыегрибы), ядерная оболочка разрушается при митозе и снова возникает последеления клеток. Это так называемый открытый тип митоза (рис.
113). Приэтом в профазе по мере конденсации хромосом ядерная оболочка теряет сними связь, а затем в ней появляются разрывы. Она приобретает видплоских мембранных вакуолей, цистерн. В это время ядерные поры ещевидны. Позднее они исчезают. Во время митоза 120 мДа комплекс ядернойпоры разбирается на субкомплексы примерно по 1 мДа. Разборка порначинаетсясфосфорилированиярядануклеопориновмитотическойcdc2/циклин B киназой.Ядерная оболочка превращается в скопление мелких мембранныхпузырьков, окружающих зону бывшего интерфазного ядра. Такие пузырькиморфологически нельзя отличить от других мелких вакуолей в цитоплазме,они вероятно сливаются с вакуолями эндоплазматического ретикулума.
Вметафазе мембранные элементы цитоплазмы оттесняются к периферическимзонам клеток микротрубочками веретена деления.Вконцеанафазы,когдапрекращаетсядвижениехромосомкпротивоположным полюсам клетки, мембранные пузырьки цитоплазмы, и впервую очередь мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума(см. ниже), начинают контактировать с поверхностью хромосом. Этиконтакты происходят сначала в небольшом числе точек, но затем начинаетсяперестройка и рост этих первичных зачатков ядерной оболочки.
Они измелких пузырьков превращаются в плоские вакуоли, которые растут вширину и обволакивают поверхность деконденсирующихся хромосом.Участки таких растущих плоских мембранных мешков сливаются, замыкая иотгораживая содержимое нового интерфазного ядра. Интересно, что ядерныепоры появляются на самых ранних этапах реконструкции ядерной оболочки,210когда двойные мембранные цистерны еще не сомкнулись и фактическиничего не разделяют.При реконструкции ядерной оболочки происходит сборка ядерных пор.Она начинается с образования ямки при слиянии внешней и внутреннейядерной мембраны, которая затем превращается в отверстие. В этомпроцессе принимают участие интегральные белки gp 210 и POM 121,которые впоследствии будут закреплять ЯПК на мембранах.За этим следует появление внутренних структур ЯПК: комплекс кольца,спиц, добавление звездчатого кольца и других структур, и, наконец,филаментов.У некоторых низших организмов в случае закрытого митоза ядернаяоболочка не исчезает, она в зоне ядерной перетяжки замыкается, чтоприводит к образованию двух новых ядер.
Здесь участие ядерной оболочки вделении клетки заключается в том, что на ней закреплены хромосомы, и она,по-видимому, принимает участие в индукции образования микротрубочек,необходимых при делении клеток.По-видимому, для реконструкции ядерной оболочки необходимымусловием является деконденсация хромосом. Было показано, что есливызвать преждевременную деконденсацию метафазных хромосом, то ониочень быстро контактируют с мембранными пузырьками и одеваются каждаясвоей отдельно ядерной оболочкой, вследствие чего в клетке возникаетмножество так называемых микроядер, каждое их которых возникло изодной хромосомы.С другой стороны, можно экспериментально вызвать разборку ядернойоболочки у интерфазного ядра. Это происходит, если слить в культуре тканидве клетки на разных стадиях клеточного цикла и получить т.н.гетерокарион, где одно из ядер будет находиться в интерфазе, а другое бытьв виде митотических хромосом в метафазе. В этом случае в интерфазномядре начинает конденсироваться хроматин, образуются преждевременно211конденсированные хромосомы, а ядерная оболочка исчезнет так же как вовремя нормального митоза (рис.
114). Эти данные говорят о том, что вцитоплазмемитотическойклеткисуществуюткакие-тофакторы,вызывающие как конденсацию хромосом, так и параллельный этому процессраспада ядерной оболочки.Сходная динамика совпадения процессов перестройки хромосом иядерной оболочки наблюдается и в другой системе, в цитоплазме ооцитовили в бесклеточных цитоплазматических экстрактах ооцитов. Так если вцитоплазму ооцита амфибий на стадии метафазы инъецировать выделенныеинтерфазные ядра, то их ядерная оболочка разбирается, а хроматинконденсируется в виде митотических хромосом.
Если же в ооцит на стадииинтерфазыввестимитотическиехромосомы,тоониначинаютдеконденсироваться, появляются множественные мелкие вакуоли, которыесливаясь друг с другом, образуют ядерные оболочки. Интересно, что вцитоплазму интерфазного ооцита можно ввести даже чужеродную чистуюДНК, которая, связываясь с гистонами в цитоплазме, образует хроматиновыеглыбки, которые в свою очередь одеваются ядерными оболочками ипревращаются в микроядра.Эти экспериментальные приемы вместе с методом иммунофлуоресценциипозволили проследить судьбу многих белков ядерной оболочки во времямитоза. Подробно изучена судьба ламинов. Было найдено, что фиброзныйслой ламинов деполимеризуется параллельно распаду ядерных мембран иконденсации хроматина. Этому предшествует обильное (в 7 раз выше, чем винтерфазе) фосфорилирование ламинов.
Ламины A и C при этомдеполимеризуются до димеров и тетрамеров и, переходя в растворимоесостояние, равномерно распределяются в цитоплазме вне связи с другимиструктурами. Ламин B тоже деполимеризуется до олигомеров, но остаетсясвязанным с мембранными пузырьками, возникшими из ядерной оболочки.212Присборкеядернойоболочкивтелофазебелкиламиныиммунохимически начинают выявляться в центромерных и теломерныхучастках хромосом, там же обнаруживаются первые признаки образованияновой ядерной оболочки. Там же накапливаются антитела к белкам поровогокомплекса. В бесклеточной системе цитоплазматического экстракта ооцитовбыло показано, что ассоциация растворимых в митозе ламинов A и Cпроисходит независимо от ламина B.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
