obshaya_tsitologia (1120994), страница 26
Текст из файла (страница 26)
К негистоновым белкам относят такжеферменты, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот (ДНК-полимеразы,ДНК-топоизомеразы, метилазы ДНК и РНК, РНК-полимеразы, РНКазы иДНКазы и т.д.), белков хроматина (протеинкиназы, метилазы, ацетилазы,протеазы и др.) и многие другие.Наиболее подробно изучены неистоновые белки т.н. группы с высокойподвижностью (HMG – high mobility group, или «белки Джонса»). Они хорошоэкстрагируются в 0,35 М NaCI и 5% HCIO4 и обладают высокой132электрофоретической подвижностью (отсюда их название). Основных HMGбелков четыре: HMG-1 (м.в. = 25500), HMG-2 (м.в.
= 26000), HMG-14 (м.в. =100000. HMG-17 (м.в. = 9247). Эта группа наиболее богата представлена срединегистоновых белков: в клетке их около 5% от всего числа гистонов. Особенночасто эти белки встречаются в активном хроматине (примерно 1 молекула HMGбелка на 10 нуклеосом). Белки HMG-1 и HMG-2 не входят в состав нуклеосом, асвязываются, видимо с линкерными участками ДНК. Белки HMG-14 и HMG-17связываются с сердцевинными белками нуклеосом, что обеспечивает, вероятно,изменение уровня компактизации фибрилл ДНП, которые становятся болеедоступными для взаимодействия с РНК-полимеразой.
В этом случае HMGбелки выступают в качестве регуляторов транскрипционной активности. Былообнаружено,чтофракцияхроматина,обладающаяповышеннойчувствительностью к ДНКазе I, обогащена HMG-белками.Петлевые домены ДНК – третий уровень структурной организациихроматинаРасшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов –нуклеосом и 30 нм фибрилл – еще мало что дает для понимания основтрехмерной организации хромосом, как в интерфазе, так и в митозе.Сорокакратное уплотнение ДНК, которое достигается при сверхспиральномхарактере ее компактизации, совершенно еще недостаточно для полученияреального (1 х 104) уровня уплотнения ДНК.
Следовательно должнысуществовать более высокие уровни компактизации ДНК, которые в конечномсчете должны определять размеры и общие характеристики хромосом. Такиевысшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственнойего деконденсации, когда было найдено, что поддержание их связано снегистоновыми белками.
В этом случае специфические белки связываются сособыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большиепетли или домены. Таким образом следующие более высокие уровникомпактизации ДНК связаны не с ее дополнительной спирализацией, а с133образованием поперечной петлистой структуры, идущей вдоль интерфазной илимитотической хромосомы.Как уже указывалось, сложная структура ядра или нуклеоида прокариоторганизована в виде иерархии петлевых доменов ДНК, связанных с небольшимколичеством специальных белков.Петлевой принцип упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотическихклеток. Так если выделенные ядра обработать 2 М NaCI, т.е. удалить всегистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того, что вокругядра возникнет т.н.
«гало», состоящее из огромного числа петель ДНК. Такаяструктура ядер получила название «нуклеоида» (это только терминологическоесходство с ядерным аппаратом прокариот). Гало (или периферия такогонуклеоида) состоит из огромного (до 50000) количества замкнутых напериферии петель ДНК, со средним размером петель около 60 т.п.н., основаниекоторых закреплено где-то внутри ядра, на участках негистоновых белков. Темсамым считается, что после удаления гистонов основания петлевых доменовДНК, связаны с т.н.
«матриксом» или «скэффолдом» - негистоновым белковымостовом интерфазного ядра. Оказалось, что участки ДНК, связанные с этимостовом, имеют особое сродство к негистоновым белкам, их состав изучен, ониполучили название MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachmentregion) участков.Оказалось, что петлевые домены ДНК интерфазных ядер можно выделить.
Ввыделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Ca++ ) вхроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 нм, т.н.хромомеры.Еслитакиехромомерыпрепаративно выделить,а затемэкстрагировать из них гистоны, то под электронным микроскопом можно видетьрозетковидные петлистые структуры, где отдельные петли отходят отцентрального плотного участка.
Количество петель в такой розетке можетсоставлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.н., ссуммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами134приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и кразворачиванию петель ДНК.Признаки петлевой доменной организации хроматина можно наблюдать спомощью электронного микроскопа после помещения ядер или хромосом всолевые растворы низкой ионной силы (0,01 М NaCI) в присутствии низкихконцентраций двухвалентных катионов ( 1 мМ).
В этих условиях не происходитдепротеинизации хроматина, он сохраняет свою нормальную химическуюкомпозицию, но значительно разрыхляется и представлен стандартнымифибриллами толщиной 30 нм. При этом в некоторых местах можно видеть, чтоотдельные сгустки конденсированного хроматина выявляют особую структуру.Это – розетковидные образования, состоящие из многих петель30 нм фибрилл,соединяющихся в общем плотном центре. Средний размер таких петлистыхрозеток достигает 100-150 нм. Подобные розетки фибрилл хроматина –хромомеры – можно видеть в ядрах самых разнообразных объектов, животных,растений, простейших (рис.
63).Особенно демонстративно такие хромомеры выявляются на тотальныхпрепаратах хроматина из макронуклеусов инфузории Bursaria. В этом случаеможно видеть, что каждый хромомер состоит из нескольких содержащихнуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны другс другом участками нуклеосомного хроматина, так что в целом видна цепочкарозетковилных структур (рис. 64).Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении политенных хромосом.Здесь хромомеры в виде розеток хроматина выявляются в зонах хроматиновыхдисков, в то время как междисковые участки их не содержат (рис. 65).
Придеконденсации хроматина ядер некоторых растений (Allium, Haemantnus, Vicia),для которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видныв составе хромонемных нитей.Подобные розетковидные петлистые структуры, хромомеры, можно видетьтакже при разрыхлении и митотических хромосом как животных, так и135растений.
Следовательно, хромосомные 30 нм фибриллы, состоящие из ДНК игистонов,упаковываютсяввидепетлистыхрозетковидныхструктур,претерпевая еще дополнительную компактизацию. Это третий уровеньструктурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600кратной компактизации ДНК (рис. 66).Важно отметить, что размер отдельных петлевых доменов совпадает сразмером средних репликонов и может соответствовать одному или несколькимгенам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белкамиядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликацииДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматинаобеспечивает не только структурную компактизацию хроматина, но иорганизуетфункциональныеединицыхромосом–репликоныитранскрибируемые гены. Комплекс белков, участвующих в такой структурнофункциональной организации хроматина, относится к белкам ядерногоматрикса.Глава 6.
Ядерный белковый матриксОбщий состав ядерного матриксаМы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутыехромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такаяорганизация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не толькодля того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособлениеот соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессоврепликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что дляосуществленияэтихзадачдолжнасуществоватькакая-токаркаснаявнутриядерная система, которая может служить объединяющей основой длявсех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки.
Такойструктурой является белковый ядерный остов или матрикс. Необходимо сразуже оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкойморфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический136гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участковхроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра,которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферическойструктурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще«ядерным скелетом».Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) быливыделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что припоследовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М растворомNaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, аосновными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка,связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок иРНК, и ядрышки.
Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина внативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие«ершика для чистки бутылок» (см. рис. 67).Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие ипривели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках ядерногоостова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время былпредложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структурядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракцийядер различными растворами. Новым в этих приемах было использованиенеионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерныелипопротеидные мембраны.Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получениюпрепаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см.
табл. 6).Таблица 6. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе полученияядерного белкового матриксаОбработкаФракцБелоиякДНКРНФосфолипиКды1371.Изолированныеядра2. 0,2 мМ MgCl2N0000LS5275192,5HS8397666,4NM90977197,8NPM909998983. 2 M NaCl4. 1% Тритон Х1005.ДНКаза+РНКазаИзолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М ТрисHCI буфера и 5 мМ MgCI2помещались в раствор низкой ионной силы (LS), гдедеградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны иДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков.Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти кполной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерногоматрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительнорастворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечнуюфракцию ядерного белкового матрикса (NPM).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
