obshaya_tsitologia (1120994), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Это наблюдение совпадает с тем, что помереудалениягистонов,особенноH1,происходитпрогрессивнаядеконденсация, разворачивание фибрилл ДНП, что возможно облегчаетвзаимодействие РНК-полимеразы с матричной ДНК. Так же было обнаружено,чтомодификациягистоновприводиткусилениютранскрипциииодновременной декомпактизации хроматина. Следовательно, напрашиваетсявывод о том, что количественное и качественное состояние гистонов влияет настепень компактности и активности хроматина. Однако оставался открытымвопрос о специфичности регуляторных свойств гистонов: какова роль гистонов122при синтезе специфических иРНК в различно дифференцированных клетках.Этот вопрос до сих пор еще не решен, хотя можно сделать некоторыеобобщения: на эту роль могут претендовать те группы гистонов, которыенаименее консервативны, такие как H1 или как H2A и H2B, которые могут взначительной мере модифицироваться и тем самым изменять свои свойства вопределенных участках генома.Была очевидна и структурная, компактизирующая, роль гистонов ворганизации хроматина.
Так постепенное добавление фракции гистонов крастворам чистой ДНК приводит к выпадению в осадок комплекса ДНП, инаоборот, частичное удаление гистонов из препаратов хроматина, ведет к егопереходу в растворимое состояние. С другой стороны, в цитоплазматическихэкстрактах ооцитов земноводных или яиц морских ежей, содержащихсвободные гистоны, добавление любой ДНК (включая фаговую) привводит кобразованию хроматиновых фибрилл (ДНП), длина которых в несколько разкороче исходных ДНК. Эти данные говорят о структурной, компактизирующейроли гистонов.
Для того, чтобы огромные сантиметровые молекулы ДНКуложить по длине хромосомы, имеющей размер всего несколько микрометров,молекула ДНК должна быть как-то скручена, компактизована с плотностьюупаковки равной 1 : 10000. Оказалось, что в процессе компактизации ДНКсуществуютнесколькоуровнейупаковки,первыеизкоторыхпрямоопределяются взаимодействием гистонов с ДНК.Первый уровень компактизации ДНК: структурная роль нуклеосомВ ранних биохимических и электронномикроскопических работах былопоказано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с диаметром от 5до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит отспособа выделения препарата.На ультратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом послефиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматированные фибриллытолщиной 30 нм.
Такие же размеры имели фибриллы хроматина при физической123фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта иполучении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалосьвоздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти методы иприемы не давали никакой информации о характере локализации ДНК игистонов в хроматиновых фибриллах.Крупным событием в изучении хроматина было открытие двумя разнымиспособами нуклеосом - дискретных частиц хроматина.
Так при осаждении наподложку для электронной микроскопии препаратов хроматина в щелочныхусловиях при низкой ионной силе, можно было видеть, что нити хроматинапредставляли собой что-то, напоминающее “бусы на нитке”: небольшие, около10 нм, глобулы, связанные друг с другом отрезками ДНК длиной около 20 нм(рис.
57, 58). Эти наблюдения совпадали с результатами фракционированияхроматина после частичного нуклеазного переваривания.Было найдено, что если подвергнуть действию нуклеазы микрококковвыделенный хроматин, то он подвергается распаду на регулярно повторяющиесяструктуры. Так ДНК, полученная из хроматина, обработанного нуклеазой,состояла из серии отрезков, кратных 200 парам оснований; встречались отрезкив 200, 400, 600, 800 и больше пар нуклеотидов (п.н.). Это говорит о том, чтонуклеазнойатакерасположенныевсоставепримернохроматиначерезкаждыеподвергаются200п.н.участкиПриДНК,этомвкислоторастворимую фракцию (низкополимерная) ДНК уходит всего 2%ядерной ДНК. Кроме того после такой нуклеазной обработки из хроматинапутем центрифугирования удается выделить фракцию частиц со скоростьюседиментации11S(S-единицаСведберга,определяющаяскоростьседиментации частиц, равна 1 х 10-13 с), а также частицы кратного этой величинеразмера: димеры, тримеры, тетрамеры и т.д.
Оказалось, что частицы 11Sсодержат ДНК около 200 п.н. и восемь гистонов (октамер) по две копиигистонов H2A, H2B, H3 и H4 и одну копию гистона H1. Такая сложнаянуклеопротеидная частица получила название нуклеосомы. Более подробный124анализ этой фракции показал, что нуклеосома устроена следующим образом:октамер гистонов образует белковую основу-сердцевину (от англ. core, часто внашей литературе этот термин используется без перевода: кор, коровая частица),по поверхности которой располагается ДНК величиной в 146 п.н., образующая1,75 оборота; остальные 54 п.н. ДНК образуют участок, несвязанный с белкамисердцевины - линкер, который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит вДНК следующей нуклеосомы. Гистон H1 связывается частично с основной,сердцевиной и с участком линкера (около 30 п.н.).
Следовательно, полнаянуклеосома содержит около 200 п.н. ДНК (146 п.н.- сердцевина, 30 п.н. участок линкера в комплексе с гистоном H1, 30 п.н. - свободная ДНК), октамерсердцевинных (коровых) гистонов и одну молекулу гистона H1 (рис. 59).Молекулярная масса полной нуклеосомы - 262000 Да. Рассчитано, что на весьгаплоидный геном человека (3 х 109 пар оснований) приходится 1,5 х 107нуклеосом.Сердцевина или коровая частица (или минимальная нуклеосома) оченьконсервативны по своей структуре: они всегда содержат 146 п.н. ДНК и октамергистонов.
Линкерный участок может значительно варьировать (от 8 до 114 п.н.на нуклеосому).Используя метод рассеяния нейтронов удалось установить форму и точныеразмеры нуклеосом. При грубом приближении – это плоский цилиндр илишайба диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Располагаясь на подложке дляэлектронного микроскопирования они образуют «бусины», глобулярныеобразования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулахДНК.
На самом же деле вытянутыми являются только линкерные участки,остальные три четверти длины ДНК спирально уложены по перифериигистонового октамера. Сам гистоновый октамер, как считают, имеет форму,напоминающую мяч для игры в рэгби, в состав которого входит тетрамер (H3 •H4)2 и два независимых димера H2A • H2B. На рис. 60 представлена схемарасположения гистонов в сердцевинной части нуклеосомы.125В фибриллах хроматина линкерный участок не линеен, а продолжая спиральДНК на поверхности нуклеосомной частицы,связывает соседние нуклеосомытак, что образуется как бы сплошная нить, толщиной около 10 нм, состоящая изтесно расположенных нуклеосом (рис. 61). При этом за счет дополнительнойспирализации ДНК (1 отрицательный супервиток ДНК на 1 нуклеосому)происходит первичная компактизация ДНК, с плотностью упаковки равной 6-7(200 п.н.
длиной 68 нм, уложены в глобулу диаметром 10 нм). Укладка почтидвух витков ДНК по периферии сердцевин нуклеосомы происходит, каксчитается, за счет взаимодействия положительно заряженных аминокислотныхостатков на поверхности октамера гистонов с фосфатами ДНК. N- и C-концевыеучастки сердцевинных гистонов, обогащенные положительными зарядами,вероятно, служат для дополнительной стабилизации структуры нуклеосомы.Ведущая роль сердцевинных (коровых) белков в компактизации ДНКпоказана при самосборке нуклеосом.
Регулируя последовательность добавлениягистонов и ДНК, удалось получить полную реконструкцию нуклеосом. В этомпроцессе не играет никакой роли источник, откуда была взята ДНК: это можетбыть ДНК бактерии и даже циклическая ДНК вирусов. Оказалось, что дляобразования нуклеосом гистон H1 не требуется, он участвует в связывании ужеготовых нуклеосом друг с другом и в образовании более высоких уровнейкомпактизации ДНК. Ключевыми в построении нуклеосом оказались гистоныH3 и H4.
При этом вначале ДНК связывается с тетрамером (H3 • H4)2 ккоторому позжеприсоединяются два димера H2A • H2B. Вероятно, высокаяконсервативность в строении гистонов H3 и H4 отражает их ведущуюструктурную роль на первых этапах компактизации ДНК при образованиинуклеосом.Нуклеосомы при репликации и транскрипцииКак же происходит образование нуклеосом при репликации ДНК, каковасудьба нуклеосом в вилке репликации, как распределяются новые и старыенуклеосомы или их белки – все эти вопросы еще до конца не разрешены.126Приэлектронномикроскопическомисследованииреплицирующегосяхроматина было обнаружено, что обе новообразованные фибриллы содержатнуклеосомы.Если учесть скорость синтеза ДНК эукариот (20 нм в секунду),то новыенуклеосомы при удвоении хромосомных фибрилл должны возникать соскоростью 3-4 сек.
Такая высокая скорость образования нуклеосом связана стем, что в момент синтеза ДНК существует уже пул синтезированных гистоноввсех классов, готовых войти в состав нуклеосом. Гистоновые гены, относящиесяк фракции умеренно повторяющихся последовательностей ДНК, представленыв виде множественных копий для каждого гистона. Они активируются вместе сначалом синтеза ДНК, поэтому по мере продвижения репликационной вилки,новые участки ДНК могут сразу взаимодействовать с новосинтезированнымигистонами. Новосинтезированные гистоны и старые гистоны в составепредшествующих нуклеосом не смешиваются при образовании нуклеосом вовремя репликации ДНК. Вместо этого октамеры гистонов, присутствующие дорепликации остаются интактными и переходят на дочерний дуплекс ДНК, в товремя как новые гистоны собираются в совершенно новые кор-частицы насвободных от нуклеосом участках ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
