В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Вместо этого оценивают частоту возникновения мутаций в хромосоме в целом. Первый такой метод обнаружения и опрелеления частоты мутаций у дрозофилы— С( — применил в 1927 г. Герма~( Мсллер. Он разработал систему, позволяющую игли- Честь (, Обтггн,тт тики Рвнтгегоеское излучение сг к С 1 В С ( + В ч- ч- ч- С ( В + + + С ( В (' С ( В "г Ч- + Погибзег Г~ ПогибеегЯ + Рис. 14.9. Методика учета летальных мутаций, возникающих в половой хромосоме у лрозофилы, с использованием хромосомы С(В.
(Из: Дубинин, 1986) чпп. вновь возникшую мутацию от уже имеющихся в генотипе. Так как наиболее обьсктивно можно учестьчастотурецессивныхлетальных мутаций, Е Меллер ввел в Х-хромосому тестерной линии дрозофилы инверсию С(, которая играет роль «запирателяи кроссинговера (С) и сблздает рецессивным летальным эффектом (() .
Кроме то~о, он маркировал Х-хромосому доминантным геном В (Ваг), редуцирующим число фасеток глаза; в результате сферические в норме глаза у самок-гетерозигот приобретают бобовидную форму, а у самцов становятся щелевидными. Самок тестерной линии С(В скрещивали с облученными самцами (в качестве мушгена могло выступать и химическое соединение).
Из первого поколения выбирали самок С(Вгч- для постановки индивидуальных скрещиваний (рис. 14.9). Так как самцы с генотипом С(В/У погибают независимо от возникновения новой летальной мугвции, в случае ее отсутствия расщепление по полу во втором поколе~ нии будет 2:1. Отсутствие во втором поколении самцов ХзгУ свидетельствует о воз- ~ ~икновении в Х-хромосоме летальной мутации. Ее частота выражается отношением числа Х-хромосом, точнее — пробирок с индивидуальными скрещиваниями, где былаобнаруженановаялетальнаямутация,кобщемучислу пробирокданной выборки.
Следует помнить, что у самок первого поколения между половыми хромосомами иногда может происходить двойной кроссинговер, что приводит к снижению истинной частоты летальных мутаций. В настоящее время метод С1В утратил свое практическое значение. Вместо него используется предложенный в дальнейшем тем же автором метод Моллер-5. Усамоклинии-анализатора: обе Х-хромосомы содержат подве инверсии, не связанные с летальным действием: зсз (редуцированные щетинки) захватывает большую часть Х-хромосомы, б49 — инверсия в средней части Х-хромосомы.
Следствием этих инверсий является практически полное исключение перекреста между Улови /4. Молекуллуллм мссоллпмы муллыелетл зсзу8 49,, зсзу8 49 " 22 а"а' зсау 8 49 зсзу8 49 зсзу 8 49 3 4 Рис. 14. 10. Метод Меллер-5 для .учета летальных и других мутаций, возникающих в Х- хромосоме у дрозофилы (Из: Дубинин, 1986). Черным цветом обозначена хромосома, несущая летальную мутацию. хромосомами. Дополнительно обе Х-хромосомы самки маркированы геном желтой окраски тела и щетинок уейои (у). Самцы в такой линии жизнеспособны.
Если у взятого для исследования самца дикого типа нет мутации в Х-хромосоме, ю, после скрещивания его с самкой из линии-анализатора, во втором поколении мы получим по 2 фенотипических класса самок и самцов (рис. 14.10). Если же в анализируемой Х-хромосоме исследуемого самца возникла летальная мутация, то во втором поколении все самцы будут принадлежать к одному фенотипическому классу (лолу с(49) — желтые с редуцированными щетинками. При этом каждая индивидуальная культура второго поколения, являющаяся потомством одной самки Рр соответствует одной исследованной Х-хромосоме самца из родительского поколения.
Метод Меллер-5, как и тест Эймса, юироко применяется для контроля химических соединений, используемых при консервировании пищевых продуктов, изготовлении косметических препаратов и т.п. Для оценки способности агентов индуцировать хромосомные мутации юироко используются цитогенетические методы учета хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей 1п уйго или гл Иуо. Недостаток этих методов состоит в том, что они достаточно субъективны (поскольку основаны на микроскопировании), требуют высокой квалификации исследователя и плохо поддаются автоматизации. В качестве альтернативы был предложен метод учета микроядер (внутриклеточцые хроматиновые образования, сформированные из ацентрических фрагментов хромосом и цельных хромосом, отставюих в анафазе из-за дефектов веретена деления) в полихроматофильных эритроцитах костного мозга грызунов, который может быть автоматизирован и, кроме того, применен к любой пролиферирующей ткани, включая гонады.
Для оценки индукции хромосомных мутаций в зародыюевых клетках млекопитающих используют учет либо доминантных летальных мутаций, либо наследуемых транелвкаций (послелний более специфичен для рс~нении данной задачи). 270 Часть 2 Общая генетика Очевидно, что максимальное приближение исследователя к оценке генетического риска вследствие действия мутагенов внешней среды возможно только при ис- ~ яигьзован ии в качестве тест-систем клеток человека. В таких экспериментах обычно использукпся лимфоциты периферической крови и, как возможный вариант — клетки костного мозга, эпителия волосяных фолликулов, а также эмбриональные фибробласты и сперматозоиды. Публиковавшиеся в периодических научных изданиях результаты тестирования ~ ~а муга ген ность свидетельствовали об отсутствии единого стандарта в этой процедурес.
В экспериментах 1п «11го различия чаше всего касались условий метаболической акгивации, т ига — уровня доз, путей введения, сроков экспозиции и некоторых других экспериментальных параметров. Значительным итогом многолетнего обобщения результатов разработки и стандартизации испытаний на генотоксичность явилось выпущенное в 1989 г. ВОЗ «Руководство по краткосрочным тестам для выявлс~ ~ив мутагенных и канцерогенных химических веществ», а также материалы 2-го Международного рабочего совещания в Мельбурне 1994 года.
Фармакологический комитет МЗ и М П Российской федерации в 1994 г опубликовал нормативный документ — методические рекомендации «Оценка мутагенности новых лекарственных средств». В рамках курируемой ВОЗ Международной программы по химической безопас~ к>сти (1п1егпайопа! Рго8гагптпе оп Сйепцса1 ВаГе1у, 1РСВ) были разработаны методические рекомендации для мониторинга генотоксических влияний на организм человека мугагепов и канцерогенов.
В последней версии рекомендаций от 2000 г. предлащстся слелующий набор тестов: 1) цитогенетические методы — классический анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, флуоресцентная гибридизация )п з)Гц (Р18Н), о прслеле н ив м и кроядер (МЯ) в л им фоц игах и эпи тел и альных клетках; 2) анализ повреждений ДНК вЂ” определение аддуктов, одно- и двухцепочечных разрывов, перекрестных сшивок, щелочелабильных сайтов с помощью биохимических и электрофоретических 1кометный тест) методик, определение сестринских хроматидных обменов (СХО); 3) учет образования аддуктов мугагена с белками и мутаций в локусе гипоксантин-гуан ин — фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ).
Один из рекомендованных тестов — кометный 1гель-электрофорез отдельной клетки) позволяет определить одно- и двухцепочечные разрывы, щелочелабильные сийты, перекрестные сшивки молекул ДНК, а также участки с неполной эксцизион~ кгй репарацией в индивидуальной клетке. Материалом для кометного теста могут служить лейкоциты и лимфоциты периферической крови, сперматозоиды, буккальпые клетки, клетки желудочного и назального эпителия, суспензию которых заклюагагг и агарозный слой на предметном стекле. Затем клетки лизируют детергентами или растворами солей, и высвобожденную ДНК подвергают электрофорезу в нейтр щьных или щелочных условиях. ДНК отдельной клетки в процессе миграции к виолу образует так называемую «комету» с характерными «головой» и «хвостом», коюрую визуализируют с помощью флуоресцентной или световой микроскопии после окрашивания соответствующими красителями.
При повреждении ДНК процесс ее ми~рации к аноду нарушен. Подсчитывают длину кометы, длину хвоста и момент улова /4. Молекуяяриые механизмы муааегчи ~ »71 хвоста (отношение длины хвосза к длине всей кометы). Нейтральный вариант комст- ПОГО 7ЕСИ ПОЗВОЛЯЕТ ОПределить диухцсночечныс раЗРывы ДНК, щелочной вариант (и зависимости от значения рН) — одно- и днухцецочечные разрывы, щелочелабильные сайты, участки с неполной эксцизионной репарацией, перекрестные сшинки ДН К-ДН К и ДН К-белок.
Чрезвычайно важно, что с помощью этого метода удается выявить фракцию клеток с поврежденной ДНК внутри большой популяции непораженных клеток. Рази ые модификации метода (применение специфических антител против поврежденных участков или специфических ферментов репарации ДНК) позволяют определить специфические классы аддукгов ДНК (например, тимидиновые димеры, участки окислительного повреждения). Согласно другому документу 1РСВ (2001 г) «Биомаркеры при оценке риска. Валидпосчпь и верификация», после окончательной расшифровки генома человека наибольшую роль при определении генотоксических воздействий будут играть методики выявления полиморфизма одиночных нуклеотидов и технологии создания микроматриц и микрочипов ДНК и белков. Тем не менее, пока в большинстве случаев оценка генетического риска основана на экстраполяции экспериментальных данных от одного тест-объекта на другой, от высоких доз на низкие и тд., и, в конечном итоге, от модельных систем 1птйгоДп иго — на человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
