И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 74
Текст из файла (страница 74)
Эта классификация методов дифференциальной окраски бьша предложена Парижской конференцией в 1971 г. Кроме того, позднее были разработаны методики дифференциального переваривания хромосом энзимами, а также флуоресцентная гибридизация ьч хйи (Г!БН). Н- и О-окраска. Эффективными в выявлении гетерохроматина являются флуоресцирующие красители, такие как квинакрин (()-окраска) и Хекст (Ноесйз! 33258 — Н-окраска). Оба они связывшотся с районами хромосом, обогащенными А — Т-парами, но механизмы окраски у них разные.
Квинакрин интеркалирует в молекулу ДНК, Хекст связывается с наружной стороны молекулы в ее узкой бороздке. ! '-окраска. Этот тип дифференциальной окраски интересен по многим причинам. Прежде всего, поперечные полосы являются удобными маркерами различных частей хромосом. Полосам присвоены определенные номера и относительно них картируют гены (рис. 9.15).
Однако, как выяснилось, число полос и их интенсивность в работах разных исследователей варьировали. Для стандартизации анализа кариотипов Парижская номенклатура устанавливает нормы числа О-полос в хромосомах 242 Стаса й СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ХРОМОСОМ Идиограмма хромосом серого хомячка (фотография О. В. Саблиной и С.
И. Раджабли) Рак груди !протоков) ' Недостагочноегь енолазы Нсйробластома" 3Гсмолитичсская анемия й2г-ноль Эрия!рггггга жлж ош да эглин нщиточ- ! Зритроксратодсрчгия варнабсльпая Гипофосфатазация младенческая грукозидаз ! !очдняя иодьожная порфирия Порфирия гспатоэритропоэтическая Недостаточность гала!!толпив!срезы Ссгогй йроТлясшоя, нейронный-!, детский Недостаточность СК, тины 1 и П Лейкемия, лимфома Т-клеточная Недостаточность ацил-СоА-дегидрогспазы, сред Болезнь кленового сиропа,тип 2 Псдостаточиошь ниоядснилатдсаминазы Недостаточность АМР-леаминазы зритроци гав Гипсрплазия надпочечников,тип П Гицотироидизм нсзооный Мионатил из-за недостатка СТР-азы Гинераммониемия из-ча недпсгагка СТР-ачы 34 ~ 3 >й 32 Р 3! ° И 2 2! ° ляя цепь 13 1 1 12 ° Болезнь Гоше, 2 и оодое типа Гсмолитичсекая анемия в рсзультатс недостатка ПК Зллиптоцитоз-2 Пиропойкилоцитоз Сфсроцитоз, рсцсссивный Недостаточность антит!чгчмбинл П! Болезнь Шарко — Мари — Туч, ! ил !б ! !одвержсннаегь мжприи, вычьгвасмой и!штаайаж игах Синдром Кри!лера — Наджара Немаяиновая миопатия Недостаточность фактора 32 Системная красная волчапка Нейтропспня иммунная Катаракта оноясьгвашпчая, пулверулснтпая Хронический грапуломатоз а резун тате недостаточности НСР-2 Гликогслоз 32П Недостаточность фактора ХШВ Недостаточность СВ! Недостаточность фактора Н Синдром Ушсра, тнп 2 Синдром ван дср Вуда Псдостяточность фумаразы 2! Ю 2 23 2Е Я 32 4! ° Гены болезней, картнрованные в первой хромосоме !МсКнз!ск, 1992.
— Из: Пузырев, 1996. С. 251. Рамкой обведены аллельные состояния; "— новообразования, связанные со специфической хромосомной перестройкой, онкогеном или потерей гетерозиготностн опухолевых клеток; курсивом отмечена несовместимость матери и плода; р — короткое, 9 — длинное плечо; 1 — 3, 1-4 — районы хромосом 248 ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕ!!Гзтр!КА !2 !ь Гт 14 29 22 Схематическое изображение О-сегментов хромосом человека и система нх обозначения согласно решениям Парижской конференции в 1971 и Цифрами обозначены номера хромосом; Х н У --- половые хромосомы; р — короткое, Ч вЂ” — длинное пдечи хромосом человека.
Кроме того, зти полосы должны быть в определенных позициях !рис. 9.16). В соответствии с номенклатурой существуют три типа карт полос, составленных при уровнях разрешения 400, 550 и 850 полос на геном человека. Кроме того, имеется вы- сокоразрешанзщая методика 11з1я1з гово!п11оп1, и карты, построенные с ее применением, включают около 1250 полос.
Маркировка хромосом с помощью !з-метода позволяет идентифицировать индивидуальные хромосомы и их фрагменты, следить за их Гэока 9. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ХРОМОСОМ 249 перемещениями в ходе эволюции, под воздействием мутагенов и различных экологических факторов. Кроме этого сам по себе набор темных полос в хромосомах отражает определенное состояние этих районов. Установлено, что районы, соответствующие б-полосам, обеднены генами, в них повышенное содержание нуклеотидов А, Т и ) 1ХГз-элементов.
ДНК из б-полос является позднореплицирующейся в Я-периоде 1Сга(я, В(скпзоге, 1993!. К-окраска. В результате инкубации препаратов хромосом в буферном растворе при высокой температуре или при определенном значении РН с последующей обработкой красителем Гимза выявляется сегментация хромосом, обратная б-сегментации.
В К-полосах высокая концентрация генов, они обогащены нуклеотидами б, С и В1ХЕ-элементами, и ДНК этих фрагментов рано реплицируется в Я-периоде. Т-окраска. Это по существу вариант К-окраски, но окрашенные фрагменты, как правило, выявляются преимущественно на концах плеч хромосом в районах теломер. В этих полосах обнаружена самая высокая плотность генов, очень высокая концентрация нуклеотидов б, С и ЯХЕ-элементов. ДНК реплицируется очень рано. Окраска по Фельгену. После мягкой и!елочной обработки с последующей длительной экспозицией в холодном солевом растворе сегментация может быть выявлена с помощью реакции Фельгена.
С-окраска. В 1970 г. Дж. Голл (3. ба1!) (рис. 9.17) и М. Пардью (М. Рагуне) обнаружили, что прицентромерный гетерохроматин (см. разд. 9.5) в хромосомах мыши после денатурации — ренатурации ДНК окрашивается красителем Гимза более интенсивно, чем эухроматин. А в 1971 г. Т. Шу (Т. Нзи) и Ф. Арриги (Р. АгйдЬ1) предложили методику обработки препаратов хромосом. позволявшую дифференцированно окрашивать эу- и гетерохроматин. Основными этапами процедуры являлись денатурация ДНК хромосом в 0,7 Х ХаОН, тепловая ренатурация (65 'С) и окраска в растворе Гимза. Обработав таким образом препараты хромосом 20 видов млекопитающих, авторы нашли, что районы прицентромерного гетерохроматина, имеющего большую плотность при обычных окрасках, также интенсивно окрашивались, а эухроматин оставался бесцветным. Авторы назвали эту процедуру обработки методикой окраски на конститутивный (С-- сопя(НШгке) гетерохроматин, или С-окраской (С-Ьапйпя).
Механизм окрашивания не выяснен. И хотя в большинстве случаев расположение С-полос Джозеф Голл (р. 1928) хромосом совпадает с локализацией сателлитных ДНК, известны и очень важные исключения, например, г-хромосома 2). ь кое( не содержит сателлитных ДНК, но обнаруживает четкую С-окраску. Кроме того, в раннем эмбриональном развитии гетерохроматин не окрашивается с помощью этого метода, но на более поздних этапах окраска этих же районов выявляется. Поскольку первичная структура ДНК сохраняется одной и той же, следует считать, что С-окраска выявляет белки, специфичные для гетерах роматина.
По результатам проекта «Геном человека», опубликованным в феврале 2001 г., около 20 ",4 геномной ДНК Пото яар)елз локализовано в С-полосах хромосом. Дифференциальное энзиматическое переваривание хромосом. Гетерогенность распределения пар нуклеотидов в митотических хромосомах обнаруживается с помощью переваривания ферментами рестрикции. Участки хромосом, обогащенные повторами, не содержащими сайты для данного фермента, остаются неповрежденными и выявляются при окраске любыми красителями на ДНК, например, бромистым этидием.
Очень часто такие участки имеются в районах прицентромерного гетерохроматина. Многоцветная флуоресцентная гибридизация )н я1Ги. В цитогенетике в 1990-х гг, по- 2бо ОБЩАЯ И МОЛЕКЪЗЛЯР((АЯ ГЕ11ГзТИКА Одновременная локализация двух фрагмегпов повторе!шой ДНК из генома полевок (МЯ голле) в митотичсских хромосомах: о —. М. гоямнеглегш~ мойя; 6 — М гголясоерияя; е М сязтльг о~ми!се; г М гшхмогиш !Е1йярйсайо е! я1., !998. Р 356!.
В верхнем ряду -.. хромосомы окрашены РАР! .— синий цвет. олин нз сятеллитов даст фиолетовый цсевдоцвет, другой — зеленый, в районах совмссз ной локялизяции Появляется ослый лссвдоцвст. В ншкнсм ряду -- локализация тех жс фрагментов (красный н зеленый цвета) ня О-окрашенных хромосомах (серый цвет) явились новые мощные методы, в основе которых лежит флуоресцентная гибридизация нуклеиновых кислот (п хаи (Йцогеясегп т хйи 1зуЬ!(сйха!(оп .--- г(Я1).
Связано это с применением новых более эффективных флуорохромов и новой аппаратуры для анализа микроскопических изображений -- цифровых фотоаппаратов, соединенных с микроскопом и компьютером (ССО-камер) вместо фотокамер. Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветная пюридизация )л зйтл. Для получения многоцветных изображений используют разные флуорохромы, которыми мстят разные зонды ДНК. Информация об интенсивности свечения каждого из флуорохромов записывается в компьютере отдельно, и ка кдому из таких изображений присваивается свой собственный псевдоцвет. Одновременное использование нескольких флуорохромов позволяет получить значительно большее число псевдоцветов.
Например, если фрагмент хромосомы, окрашенный флуорохромом и, оудет давать один псевдоцвет, фрагмент. окрашенный флуорохромом Ь, - — другой, то фрагмент, окрашенный а и Ь одновременно, будет давать третий псевдоцвет (рис. 9.18). В дополнение к этим двум флуорохромам обычно используют третий — для общей окраски хромосом. Очевидно. что использование и флуорохромов позволяет одновременно определять локализацию 2" — 1 фрагментов ДНК.
24-цветная Р!БР(-окраска хромосом человека (Регсизон-бпшй, 1997.-- Из: Рубцов, Карамышева, 2000); а —. метяфязцяя нляспшкя, ня которой кязядяя хромосоме окрашена в свой нсевдоцвсз: 6 — яяличие зеленого и красном нсевдоцветоя в 8-й н 11-й хромосомах свидетельствует о тряьшлокяции между ними То есть применение пяти флуорохромов дает возможность анализировать результаты одновременной гибридизации ьч яйи 31 фрагмента ДНК.
Для мечения каждой хромосомы своим цветом Д1-!К этой хромосомы собирают микро- манипулятором с препарата, амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции и метят комбинацией из трех флуорохромов. В результате данная хромосома приобретает свой псевдоцвет. Аналогичную операцию проводят с дру! ими хромосомами, в результате чего каждая хромосома кариотипа приобретает свой собственный псевдоцвет (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
