И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 69
Текст из файла (страница 69)
К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной илн плазмидной ДНК в ДНК клеток животных. Гомологичная рекомбипация происходит между двумя дуплексными молекулами ДНК. Следует подчеркнуть. что ферменты, участвующие в этом процессе, могут использовать в качестве субстрата любую пару гомологичных последовательностей.
Молекулярные события кроссинговера приурочены к определенным стадиям мейоза1рис. 8.17). Началом профазы мейоза можно считать Ггоаа 8. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МУТЛГЕНЕЗА, РЕПАРАЦИИ ДНК, КРОССИНГОВЕРЛ... 227 Участок сочленения Сочленение ()огпг) объединяет две молекулы ДНК в том месте, где произошел кроссннговср 1А1Ьетгз сг а1., 1994.
Р. 264). Участок сочлснсння может иметь длину в несколько тысяч нуклсотидов стадию, на которой становятся видимыми индивидуальные хромосомы. В каждой из этих хромосом ДНК уже реплицирована и содержит две сестринские хроматнды, состоящие из дуплексной ДНК. Гомологичные хромосомы притягиваются друг к другу, конъюгируют в одном или более районе, формируя биваленты.
Когда процесс спаривания хромосом завершен„ хромосомы соединяются латерально за счет структуры, называемой синаптонемальным комплексом. Рекомбинация между хромосомами подразумевает физический обмен частями, происходящий по принципу «разрыв и воссоединение», в ходе которых две несестринские хроматиды рвутся и затем воссоединяются. Когда хромосомы начинают расходиться, их контакты между собой остаются в виде так называемых хиазм. Традиционно считается, что хиазмы представляют собой отражение существования кроссинговера, хотя формальных доказательств этой связи до сих пор не получено. У прокариот известны ферменты, вовлеченные в каждый этап рекомбинации, и кодирующие их гены, имеющие название лес.
Мутации этих генов фенотипически проявляются в неспособности к рекомбинации. Идентифицировано 10-20 таких генов [1 еьч)п, 20001. По-видимому, первым шагом к началу рекомбинации ДНК является сближение двух дуплексных молекул ДНК. Для обмена между дуплексами ДНК необходимо образование по крайней мере двух брешей - — ников. В механизме общей рекомбинации скоординированное образование этих ников и запечатывание разрывов возможно только тогда, когда две спирали ДНК имеют обширные районы гомологин.
Для того чтобы получить структуру, изображенную на рис. 8.18, необходимо, чтобы в каждой из четырех цепей образовалась брешь с последующим лигированием. Существует много доказательств того, что даже единственной бреши только в одной цепи молекулы ДНК достаточно для инициации общей рекомбинации.
Химические препараты или облучение, приводящие к образованию однонитчатых ников, будут стимулировать рекомбинацию. У мутантов фага 2 существуют особые участки ДНК (сггг), способствующие инициации рекомбинации: мотивы нуклеотидов длиной по 8 пн, которые сами по себе рекомбинацию не вызывают, но необходимы для нее. Они стимулируют рекомбинацию в ДНК по соседству, на расстоянии до !0 тпн.
Процесс активируется в результате возникновения двухцепочечного разрыва в нескольких тысячах пар нуклеотидов от с/и, причем в определенной ориентации. Сайты сггг являются мишенями для действия комплекса ферментов, кодируемых генами Е. стг1г' гесй, С Р (рис. 8.19). Вначале белки КесВ. С, Р связываются с двунитчатым разрывом в ДНК, затем перемещаются, расплетая ДНК и деградируя Зчконец цепи. Когда комплекс достигает локуса сйг, он тормозится и расщепляет одну из цепей в этом покусе, после чего теряет белок Р. Комплекс вследствие этого утрачивает нуклеазную активность. В результате действия КесВ, С, Р возникает свободный конец ДНК («усик»), что инициирует формирование участков сочленения гетеродуплексов. На рис.
8.20 показано, как «усик» может инициировать взаимодействие между двумя комплементарными нитями ДНК. Процесс, однако, более сложен. Для того чтобы цепь из одной гетеродуплексной молекулы смогла внедриться в другую, у Е.со1г функционирует белок КесА, кодируемый геном несА. Белок КесА в виде больших кооперативных кластеров плотно связывается с однонитчатой ДНК, образуя нуклеопротеиновый филамент. В нем имеется несколько сайтов связывания с ДНК, поэтому есть возможность держать одиночную и двойную цепи ДНК вместе. Эти ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА 228 Вссн, С, !Э растьзстаст и дсгратзлзуст ДНК как зкзонуклсаза "я!Ьявг НссВ, С, О гормозится в сйд зидоиуклсаза щеиит одиночную цепь Ясен лиссоггиируст в иослслователзщости сяи ВссВ, С продолжает действовать как гсликаза Действие белкового комплекса КесВ, С, О (ьечг!и, 2000. Р.
427) Обьяснения в тексте Образование одиопепочечиого разрыва Осман цепями ДПК Образование одиночной ннтв ДПК -в Первоначальный обмен нитями в схеме общей рекомбинации (Айгепя е! а!., !994. Р. 2б5) Ггесп, С, О связывается с двухоспочсчным разрывом = $Ф' сайты позволяют белку КесА катализировать многоступенчатую реакцию (называемую синапсисом) между двухцепочечной молекулой ДНК и гомологичными районами одноцепочечной.
Первым шагом в синапсисе является спаривание комплементарных последовательностей нуклеотидов. В результате образуется трехцепочечная структура. После этого короткий гетеродуплексный участок, в котором нити из двух различных молекул начинали спариваться, увеличивается из-за «миграции ветви» (рис.
8.21). «Миграция ветви» может происходить в любой точке, где две одиночные цепи ДНК, имеющие одинаковые последовательности, конкурируют за возможность спаривагься с одной и той же комплементарной цепью. Не- спаренный участок одной из одиночных цепей заменяется спаренным районом другой, двигая точку ветвления. Спонтанное движение ветви равновероятно в любом направлении (рис. 8.21, а).
Поскольку белок КесА катализирует однонаправленное движение ветви, это создает район гетеродуплекса длиной в несколько тысяч пар оснований (рис. 8.21, б). После этого у большинства изученных организмов наступает стадия формирования перекрестного обмена цепей, нли структур Холлидея (рис. 8.22). В этих структурах две гомологичные молекулы ДНК, которые раньше были спарены, теперь удерживаются вместе за счет сформировавшихся обменов между двумя из четырех цепей: по одной из каждой молекулы ДНК. Структура Холлидея имеет две особенности: 1) точка обмена между цепями может быстро мигрировать вперед и назад; 2) она состоит из двух пар цепей — — одна пара пересекающихся и одна пара непересекающихся.
Глава 8. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МУТАГЕНЕЗА, РЕПАРАЦИИ ДНК, КРОССИНГОВЕРА... 229 3 Две гомологичныс спирали ДНК : 3 о Двиясепис белков 5 Перекрестный обмен цепей ДНК !структуры Холлидея) !А1Ьенв е1 а1., 1994. Р. 26Е! Т ' '-:-"-':":-:-' -- '""""тТтзттЗтттэтЗ 3 5 и.,а;,.- Два типа миграции ветви, наблюдаемые в экспериментах 1и гйго !А!Ьепз е! а!., 1994. Р. 2Ь71: а — спонтанная миграция вперед и назад; 6 — однонаправленная миграция, контролируемая белками 1 Образование однопепочечных разрывов н обмен цепями Образование одноцепочечных разрывов и оомен цепями Лигирование нитей с разрывами гзо ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Две гомологичныс хромосомы Кольпсмья хромосома бакгсрнофага 2 Онсцггфичсский сай~ нриааеиинения йакгериофага Бахтсриальная хромосома Ооразонанис крегоюбразной отру кгуры л-ннтсграз» Интсгравв раврсяасг ДНК хромосом Вращение в другой плоскости Отсоединение нкгсграхы ! Дне хромосомы после кроссинговера | Разрезание ооснх цепей ДНК Изомернзацня перекрестного обмена цепей !А!Ьенв е! а1., !994.
Р. 2бг)! ДНК бакгериофага, вогросниая в бакгсриаяьиую хромосому Инсерцня ДНК бактернофага 2 в бактернальную хромосому [А1Ьег!в е! а!.„1994. Р. 271] Может происходить изомернзация 1рис. 8.23): после серии вращений исходно непересекающиеся молекулы становятся пересекающимися, и наоборот. Изомеризация может происходить спонтанно и под контролем клетки. Для того чтобы восстановить две раздельные спирали ДНК и таким образом закончить процесс спаривания молекул. две пересекающиеся цепи должны быть разрезаны. Если они разрезаны до изомеризации, две исходные спирали отделяются одна от другой почти неизмененными. Если пересекающиеся нити разрезаны после изомеризации, одна секция каждой из исходных спиралей ДНК соединяется с секцией другой молекулы, другими словами, две спирали ДНК испытывают кроссинговер.
8.3.2. Сайт-специфическая рекоаабияация 8.3.2.1. Характеристика процесса В отличие от общей рекомбинации, сайтспецифическая рекомбинация происходит под Гапка 8. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МУТАГЕНЕЗА. РЕПАРАЦИИ ДНК, КРОССИНГОВЕРА... 231 А В гкт А Гйт !э ч с гит О "" В Гйт ГВТ Ммиммаеа ГВТ Результаты сайт-специфической рекомбинации в плазмиде 2и с1тс!е дрожжей !Оо!ць Ь1ппяп!а!, !989. Р. 500): а — реаомбинация между инвертированными, б — прямыми повторами ГКТ 8.3.2.2. Экспериментальная сайтспецифическая рекомбинация у дрозофилы контролем ферментов, опознающих специфические последовательности нуклеотидов, присутствующие на одной или двух рекомбинирующих молекулах. С помощью этого типа рекомбинации бактериальные вирусы и мобильные элементы перемещаются по геному.
Сайт-специфическая рекомбинация была открыла в результате исследований механизма перемещения бактериофага 1 по хромосоме Е.сой. В интегрированном состоянии вирус внедрен в бактериальную хромосому и реплицируется как часть ДНК клетки-хозяина. Когда вирус проникает в клетку, на матрице вирусного гена синтезируется фермент 1-интеграза. Этот фермент и катализирует процесс рекомбинации, начинающийся тогда, когда несколько молекул белка ннтегразы плотно связываются со специфическими последовательностями на кольцевой хромосоме фага. Получившийся ДНК-белковый комплекс теперь связывается со сходными, но не идентичными последовательностями на бактериальной хромосоме, сближая тем самым бактериальную и фаговую хромосомы (рис. 8.24).
Затем интеграза делает надрезы в молекулах ДНК, формируя маленький участок сочленения гетеродуплекса. Интеграза напоминает ДНК-топонзомеразу в том отношении, что она формирует ковалентную связь с ДНК в тех же местах, где и разрывает. Тот же самый механизм сайт-специфической рекомбинации приходит в действие, только в обратном направлении, когда фаг 1 вырезается из сайта интеграции. В геноме дрожжей существует система ГЬР, которая содержит все необходимое (рекомбиназу) для индукции рекомбинации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
