part5 (1116455), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Параметры, по которым контролируют изменения качестваколонкиЧисло теоретическихтарелок, NФактор удерживания, kСелективность, α.Коэффициентасимметрии, As.Обратное давлениеколонки, ∆РНаиболее частыми причинами уменьшениячисла теоретических тарелок являютсяобразование полостей в колонке и еёзагрязнение. Пики на хроматограмме становятсяшире, эффективность падает. Проверяя число N,можно обнаружить проблемы ещё до того, какони повлияют на разделение.Изменение фактора удерживания при одних итех же условиях хроматографированияуказывает либо на смывание химическипривитой фазы с колонки, либо на загрязнениеколонки несмывающимися примесями.Изменения k могут быть вызваны изменениямисостава подвижной фазы, что часто приводит кошибочному мнению о неисправности колонки.Изменение селективности является ещё однимсвидетельством, наряду с факторомудерживания, смывания привитой фазы,загрязнения колонки или изменения составаподвижной фазы.Коэффициент асимметрии является меройсимметричности пика.
Увеличениекоэффициента асимметрии (появление "хвоста")пика указывает на возможное образованиеполости в колонке, но также может бытьвызвано взаимодействием полярного образца ссиланольными группами силикагеля врезультате смывания привитой фазы.Увеличение обратного давления колонкиуказывает, как правило, на то, что входной фритзабился механическими частицами. Резкоеувеличение обратного давления может бытьтакже вызвано образованием полости врезультате разрушения упаковки колонки.190Возникновение проблем с селективностью в случае полярныхслабоосновныхислабокислыхвеществ,какправило,вызванонекорректным вводом образца (образец растворен не в подвижной фазе,рН и ионная сила раствора не обеспечивают полного протонирования илидепротонирования исследуемых компонентов и т.д.).
В некоторых случаяхизменение селективности связано с влиянием остаточных активныхсиланольных групп сорбента. Для его устранения следует установить рНподвижной фазы около 3 или добавить в элюент 10-50 мМ триэтиламина(ТЭА). Это позволит "закрыть" остаточные силанольные группы наповерхности силикагелевой матрицы. Все эти действия значительноулучшат воспроизводимость анализа при смене колонок для такихвеществ. Оптимальным же решением в данном случае было быиспользование специальных колонок со сверхочищенной силикагелевойматрицей и двойным покрытием функциональными группами (например,колонки Luna C18(2) или С8(2) фирмы Phenomenex), обеспечивающимиуникальную воспроизводимость при анализе полярных соединений.Изменения селективности за счёт привитой фазы могут быть устраненыпри помощи варьирования силы элюента (содержания органическогокомпонента).7.5.
Проблемы воспроизводимости между параллельными вводамипробыЕсли время удерживания (TR) или разрешение (Rs) пиков невоспроизводятся от анализа к анализу и даже ото дня ко дню, то точностьданного ВЭЖХ метода не может считаться удовлетворительной. Плохаявоспроизводимость вызвана, как правило, либо изменениями в условияххроматографирования,либоизменениемэффективностиколонки.Проблемы с воспроизводимостью, вызванные изменением эффективности191колонки, выражаются обычно изменением удерживания или ухудшениемсимметрии пика.
В табл. 8.12. приведены возможные характерныесимптомы причин плохой воспроизводимости анализов, связанных сколоночными изменениями, а также наиболее вероятные и необходимыедействия по их предотвращению. Несмотря на то, что приведённая в табл.8.12информацияотноситсякхроматографическимсистемамкакизократического, так и градиентного элюирования, при градиентномэлюировании есть ряд дополнительных особенностей. Стандартнаяколонка 250х4.6 мм имеет внутренний объём приблизительно 2.5 мл итребует, по крайней мере, 10-15 объёмов подвижной фазы для достижениясостояния равновесия.
Это необходимо учитывать при составлениипрограммы градиента. Самая распространенная ошибка заключаетсявтом, что по окончании градиентного элюирования колонку либо забываютсмыть сильной фазой, либо после смывки задают недостаточное время длядостижения равновесия, необходимое для начала следующего анализа,либо то и другое наблюдается одновременно. При недостаточной скоростиформированияградиентаотдельныекомпонентыпробымогутнакапливаться в колонке, постепенно загрязняя её. Например, если дляанализа требуется градиент подвижной фазы с начальным содержаниеморганического модификатора 10% и конечным - 70%, то для того, чтобысмыть с колонки все компоненты пробы этого может быть недостаточно.Необходимо создать концентрацию 75 - 100%. Если колонка сильнозагрязнена, то необходимо сначала промыть её обратным током с расходомв 5 раз меньшим рабочего.
Отсоедините колонку от детектора, перевернитееё и вымойте из неё весь буферный раствор(если таковой использовался)водой. После этого перейдите на 100% органический растворитель.Наиболее приемлемым для этих целей является ацетонитрил, так как вобращённо-фазовой хроматографии он обладает большей элюирующейспособностью, чем метанол.192Таблица 50.
Причины плохой воспроизводимостиИзменения условийхроматографированияИзменения эффективностиколонкиИзменение подвижной фазы:- рН- процент органическогомодификатора- концентрация буферногораствора- концентрация добавок(ион-парного реагента)- профиль градиентаИзменение температурыЗагрязнение колонкиИзменение скорости потокаПотеря привитой фазыКолонка неуравновешеннаКолонка перегруженаЕсли этого оказалось недостаточно, перейдите на пропан-2-ол, которыйболее эффективно растворяет многие белки, пептиды и жиры и являетсяболее сильным растворителем, чем ацетонитрил или даже ТГФ.
При этомпомните, что вязкость пропан-2-ола значительно выше, чем ацетонитрилаи метанола, поэтому расход по сравнению с рабочим должен быть сниженне менее чем в 3-4 раза.Плохая воспроизводимость параллельных вводов пробы может бытьвызвана и плохой воспроизводимостью смешения компонентов ПФ.Данная причина относится исключительно к недостаткам конструкцииВЭЖХ систем. Для ее устранения следует помнить, что в ВЭЖХ системахс формированием градиента на линии высокого давления динамическиемиксеры обеспечивают значительно более высокую воспроизводимостьсмешения, чем статические смесители потока.
Особенно сильно этопроявляется при смешении растворителейсильно отличающихся повязкости. В системах градиентного элюирования с формированием193градиента на линии низкого давления воспроизводимость смешениясильно зависит от степени дегазации компонентов и правильной работысоленоидных клапанов программатора градиента и геометрии камерысмешения.7.6. Регенерация загрязненных колонок.Технически наиболее удобный метод разделения – изократическаяВЭЖХ. Если при этом подвижная фаза постоянного состава обладаетнедостаточной элюирующей силой для того, чтобы смыть сильноудерживающиеся (не анализируемые) компоненты пробы с колонки, онинакапливаются на сорбенте, и эффективность колонки будет постепенноухудшаться.
Основными симптомами загрязнения колонки являются:увеличение перепада давления, изменение времён удерживания, широкие и«хвостящие» несимметричные пики, потеря разрешения.Эффективность загрязнённой колонки может быть в большинствеслучаев восстановлена путем продолжительной промывки сильнымрастворителем, например, 100% ацетонитрилом. Если это не помогает, тоследуйте инструкциям по регенерации колонок, приведённым ниже.Регенерация обращённо-фазовых колонок с внутреннимдиаметром 4.6 мм:1. Подсоединитеколонкукхроматографувпротивоположномнаправлении.2.
Промойте колонку от буферных растворов и солей обратным током25 мл воды со скоростью 0.2-0.3 мл/мин.3. Промойте колонку 25 мл пропан-2-ола с расходом 0.2-0.3 мл/мин.4. Промойте колонку 25 мл метиленхлорида с расходом не более 0.5мл/мин.5.
Промойте колонку 25 мл гексана с расходом не более 0.5 мл/мин.194Таблица 51. Устранение плохой воспроизводимости по удерживаниюПричины плохойвоспроизводимостиКолонканеуравновешеннаЗагрязнённаяколонка.Потеря привитойфазыПерегрузка колонкиСимптомыНеобходимые действия1) Уделяйте большевремениуравновешиваниюколонки. Перед вводомпробы промойте колонкукак минимум 15 объёмамиподвижной фазы (35 млдля колонки 250 х 4.6 мм).2) Если для анализанеобходим слабыйэлюент, промойтеколонку сначала болеесильным растворителем.– Продолжительное 1) Промойте колонкууменьшение времениобратным током сильнымудерживаниярастворителем с расходомв 5 раз меньшим по– Неправильнаясравнению с рабочим.форма пика– Увеличивающееся 2) Если промывка непомогает, заменитедавлениеколонку.В следующий разиспользуйте предколонку.Замените колонку, если– Систематическоеона больше неизменение (обычноудовлетворяет вашимуменьшение) времёнзапросам.
Используйтеудерживанияспециальные колонки,– Неправильнаястабильные в широкомформа пикадиапазоне рН.1) Разбавьте пробу перед– Уменьшениевводом.времениудерживания при2) Подберите колонку сувеличении массыбольшим внутреннимвведённого образцадиаметром.– Постоянноеувеличение илиуменьшение времёнудерживания– Неправильнаяформа пика1956. Промойте колонку ещё раз 25 мл метиленхлорида с расходом неболее 0.5 мл/мин.7. Промойте колонку ещё раз 25 мл пропан-2-ола с расходом 0.2-0.3мл/мин.8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
