part5 (1116455), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Гидролизнаиболее ярко выражен при использовании подвижных фаз с рН < 3. Прииспользовании таких подвижных фаз следует использовать специальнопредназначенные для этого колонки (в том числе и с силикагельнойматрицей), например, обращённо-фазовые колонки серии Luna фирмыPhenomenex. При работе вблизи нижней границы данного диапазонаследует избегать повышения температур подвижной фазы выше 60 °С.Таблица 47.
Проблема – наличие неидентифицируемых («лишних») пиковВозможная причинаНеобходимые действия1. Проба содержит примеси, неПроверить калибровку,предусмотренные методикой анализа проанализировать стандартныеобразцы.2. Загрязнена колонка.Промойте или замените колонку.3. Износилась предколонка.Замените предколонку.4. Загрязнен инжекторПромойте инжектор5. Загрязнена подвижная фазаЗамените элюент6. Воздушные пузырьки в системеДеаэрировать элюентВторая причина – образование пустого пространства на входе вколонку, вызванное проседанием сорбента.
Это приводит к резкомуснижениюэффективностиколонки(резкомууменьшениючислатеоретических тарелок N), а также ухудшению разрешения, увеличениюразмывания пиков, их расщеплению на дублеты и появлению " хвостов".Причинами проседания могут быть: а) повышенное (более допустимого)давление на входе в колонку или гидравлический удар (одна из наиболеечасто встречающихся причин), вызванный резким сбросом давления; б)плохо набитые колонки, "проседающие" в процессе использования; в) в184результате использования подвижных фаз с высоким значением рНпроизошло растворение силикагеля в колонке. Для предотвращения этогоследует поддерживать в системе давление, не превышающее 17-19 МПа.Не допускайте скачков давления.
Помните, что при смене колонки или ПФнеобходимо дождаться снижения давления до 1 – 1.5 Мпа и только послеэтого приступать к демонтажу колонки и промывке системы. Припроседании(сорбентсорбентаколонки,входепроседаетнавызванномобычногидравлическимболеечемнаударом1-2мм),хроматографические параметры ухудшаются скачкообразно. В этом случаепроизводительобязательств,(поставщик),таккаккакправило,подобныенедействиянесетявляютсягарантийныхгрубейшимнарушением условий эксплуатации любой (не только обращенно-фазовой)колонки для жидкостной хроматографии. При использовании подвижнойфазы с рН >7, её температура не должна превышать 40°С во избежаниерастворения силикагелевой матрицы. При необходимости применениящелочныхподвижныхфаз(рН>7)используйтеспециальнопредназначенные для этого силикагелевые колонки (обращённо-фазовыеколонки серии Luna фирмы Phenomenex способны стабильно работатьвплоть до рН=10) или же колонки на полимерной основе.
Для остальныхколонок рН подвижной фазы не должен превышать 7.Третьей причиной неисправности колонки может стать оченьпрочное удерживание на привитой фазе отдельных компонентов пробыили подвижной фазы. Это приводит к ухудшению разрешения иизменению времён удерживания пиков. Это такжеможет пагубноповлиять на форму пиков. Механические примеси и выпавшие в осадоккомпоненты пробы или соли буферных растворов также могут испортитьколонку, забивая входной фрит или сорбент. Причины загрязненияколонки: а) проба содержит компоненты, не смывающиеся с колонкиподвижнойфазойданногосостава.185Эточастонаблюдаетсяприиспользовании подвижных фаз с малым содержанием органическогокомпонента; б) примеси в подвижной фазе адсорбируются на неподвижнойфазе колонки.
Это часто происходит при использовании ион-парныхреагентов или других добавок в сочетании с подвижной фазой с малымсодержанием органической составляющей и изократическим режимомэлюирования; в) механические примеси в пробе или подвижной фазе,забивающие входной фрит колонки.Для предупреждения этой ситуации, требуется очистка образца перединжекцией, подразумевающая фильтрацию или центрифугирование пробыдля удаления механических примесей и твердофазную экстракцию дляудаления высоко удерживаемых компонентов пробы.
Используйте толькоособо чистые растворители и реактивы для подвижной фазы и незабывайте фильтровать буферные растворы. По возможности откажитесьот применения ион-парных реагентов, в качестве ион-парных реагентовпри работе на обращенной фазе не используйте вещества, содержащие вуглеродных цепях более восьми атомов углерода (например, применениететрадециламмоний бромида приводит к его необратимой сорбции наобращенной фазе). Для того чтобы смыть высоко удерживаемые примеси снеподвижной фазы колонки промойте её в течение продолжительноговременисильнымрастворителем(такимкак100%ацетонитрил).Поместите в линию между инжектором и колонкой предколонку, котораябудетадсорбироватьнесмывающиесякомпонентыизащищатьаналитическую колонку.
Не забывайте своевременно менять предколонки.Правила эксплуатации нормально-фазовых колонок аналогичныизложенным в табл. 48. Ониболее требовательны к процедуререгенерерации, колонки для НФХ так же не рекомендуется хранить всухом виде.Дляпродленияслужбыаналитическойколонкиприменяюттакназываемые предколонки. Основная роль, которую играет предколонка в186хроматографической системе – роль ловушки сильно удерживающихся нааналитическойколонкепримесейимеханическихчастиц.Онаустанавливается в линии между инжектором и аналитической колонкой.Защищая при помощи предколонки свою аналитическую колонку, можносущественно продлить срок ее службы. При этом важное значение имеетсвоевременная замена износившейся предколонки.
Несмотря на то, чтоточно определить необходимость замены предколонки при работе сданным образцом и подвижной фазой можно лишь при наличиисоответствующегоопыта,существует несколькоколичественныхпараметров, способствующих принятию верного решения. Среди них –число теоретических тарелок N, рабочее давление Р и разрешение Rs.ЕслиN, Р или Rs изменились более чем на 10%, необходимо заменитьпредколонку.Таблица 48. Правила эксплуатации обращенно-фазовой колонкиСводите к минимуму скачкидавления в хроматографическойсистемеВвод пробы осуществляйте резкимповоротом ручки инжектора дляснижения гидравлического удара.Обеспечьте наименьшую пульсациюнасосов, вызванную, как правило,непостоянной объёмной скоростьюподвижной фазы (фаза недегазирована). Избегайтегидравлических ударов.Используйте предколонку или"in-line" фильтр с диаметром пор0.5 мкм.Подсоедините их в линию междуинжектором и аналитическойколонкой.
Фильтр задержит крупныемеханические частицы, апредколонка предотвратит попаданиесильно удерживаемых примесей нааналитическую колонку.187Как можно чаще промывайтеколонку сильным растворителем.Перед вводом "грязной" пробы вколонку необходимо провестипробоподготовку для удалениямеханических частиц и сильноудерживающихся на колонкепримесей.Колонки на силикагелевой основеиспользуйте с подвижнымифазами, рН которых лежит вдиапазоне от 3 до 7.Обычно бывает достаточно промытьколонку 100% ацетонитрилом. Тем неменее, если необходим болеесильный (менее полярный)растворитель, то можно применитьметиленхлорид, являющийся однимиз наиболее сильных растворителей вобращённо-фазовой хроматографии.При промывке помните осовместимости растворителей ивозможности образования осадков.Многие сильные органическиерастворители не смешиваются сводными подвижными фазами ибуферами, поэтому до и послеиспользования метиленхлориданеобходимо перемыть колонкупропан-2-олом.В качестве пробоподготовкииспользуйте такие приёмы, кактвердофазная экстракция, фильтрациячерез пористый фильтр ицентрифугированиеДля работы за пределами данногодиапазона используйте специальнопредназначенные для этогосиликагелевые колонки или колонкина полимерной основеПри работе с буфернымиДолго стоящие водные растворырастворами используйте толькобыстро "зацветают", что приводит ксвежеприготовленные буферы.нестабильности базовой линии иЕсли это невозможно добавляйте загрязнению колонки.
Помните, чтов ёмкость 100 - 200 мг/л азидаазид натрия очень ядовит и понатрия для предотвращения роста токсичности сопоставим сбактерий.цианидами.Кроме того, ацетонитрил являетсяПеред хранением илихорошим растворителем длятранспортировкой колонкихранения, в отличие от водных иотмойте её от солей и буферныхспиртовых смесей, способныхрастворов и оставьте в чистомускорять гидролиз неподвижнойацетонитрилефазы.188Несмотря на то, что вышеперечисленные параметры являютсядостоверными критериями принятия решения о замене предколонки,нельзя быть на сто процентов уверенным в том, что предколонка должнымобразом защищает аналитическую колонку. Аналитическая колонка можетзагрязняться из-за перенасыщения предколонки и без видимого изменениявышеперечисленных параметров.
Поэтому лучше произвести заменупредколонки как можно раньше. В отсутствии иной информации хорошейпривычкой является замена предколонки после 150 вводов пробы или 1000объёмов подвижной фазы.7.4. Проблемы изменения селективности колонокПри переходе на новую колонку могут возникнуть нежелательныеэффекты ухудшения селективности. Изменения селективности колонкимогут быть вызваны изменениями взаимодействия компонентов пробы схимически привитой фазой или силикагелевой матрицейсорбента.Удерживание зависит от длины химически привитых алкильных групп(С18, С8 и т.д.) и степени покрытия ими матрицы.
Также возможнывзаимодействия между компонентами пробы и активными силанольнымицентрами или примесями металлов на поверхности силикагелевойматрицы. Примеси металлов увеличивают кислотность силикагеля, врезультате чего остаточные силанольные группы депротонируются дажепри низких значениях рН и сильно взаимодействуют с основнымивеществами.Незначительныеизмененияматрицымогутвызватькардинальные изменения селективности, а также формы пиков, вособенности у основных соединений.Большие различия значений фактора разделения α (>10%) для двухгидрофобных соединений, например, антрацена и нафталина указывают наразличияпривитойфазы.Большие189различияселективностидлягидрофобного и полярного веществ основной природы (например, толуолаи диметиланилина) указывают на различие свойств матрицы сорбента.Таблица 49.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
