Ферментативное определение фенолов с использованием пероксидазы хрена после их разделения методом тонкослойной хроматографии (1113624), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Проведение реакции пероксидазного окисления ОД и ТМБ насиликагеляхВ работе [9] были изучены и выбраны оптимальные условия окисления ОД и ТМБ,катализируемого пероксидазой хрена, иммобилизованной на силикагелях : фталатныйбуферный раствор (рН 5,0), концентрации ОД и ТМД – 5 мМ, пероксида водорода – 10мМ.Реакцию ферментативного окисления ОД проводили по методике 1 (разд. 3.4.) насиликагелях № 1–3.На носителе № 1 провели четыре серии экспериментов для изучения влиянияконцентраций реагентов в реакционной системе на скорость индикаторной реакции,изменяя объёмы реагирующих веществ (объём фталатного буферного раствора (рН 5,0) вовсех экспериментах был одинаковым, и равным 2 мкл).Условия и результаты эксперимента приведены в табл.
7.Таблица 7Проведение индикаторной реакции окисления ОД на силикагеле № 1(P=0,95,n=5).ЭкспкриментабвгОбъёмОбъёмпероксидазы субстратахрена, мклО, мкл22322322Объёмпероксидаводорода, мкл2223Времяпереходаокраски, с17,4±4,317,6±1,720,4±2,112,4±2,6ЦветапереходовЗелёный–бурый–красныйВ процессе окисления ОД наблюдали переход окраски зелёный–бурый–красный ификсировали время появления красного конечного продукта окисления ОД.При увеличении объёма фермента скорость реакции не изменялась, а при введении 3мкл ОД скорость значительно уменьшалась. При увеличении объёма пероксида водородавремя появления красной окраски заметно уменьшилось, переход окрасок стал болеечётким и удобным для визуальной детекции. Далее на силикагелях № 2 и № 3индикаторные реакции проводили по методикам а и г (табл.
7).При работе на носителях №2 и № 3 также наблюдали переход окрасок зелёный–бурый–красный, при этом на носителе № 2 он был более контрастный, а на носителе № 3крайне нечёткий и неудобный для визуальной детекции из-за размывания пятен и сильногоизменения цвета полимерной подложки при смачивании. Кроме того, ухудшаласьвоспроизводимость результатов измерений скорости реакции на носителе № 3 (табл.
8).Таблица 8Проведение индикаторной реакции окисления ОД на силикагелях № 2,3(P=0,95, n=5).№ силикагеля2УсловияагВремя перехода, с7,7±0,88,0±1,1sr0,100,143аг9,5±2,97,2±1,70,310,24Цвета переходаЗелёный–бурый–красныйСиликагель № 3 в дальнейшем эксперименте решено было не использовать из-занеудобства визуального контроля скорости реакции пероксидазного окисления ОД иплохой воспроизводимости результатов измерений.Реакцию пероксидазного окисления ТМБ проводили по методике 1 (разд. 3.4.),добавляя аликвоты компонентов согласно методам а и г (табл.
7).При ферментативном окислении ТМБ наблюдали переход окрасок голубой–жёлтый–оранжевый и фиксировали время появления жёлтого продукта, так как этот переход резкийи более удобный для визуального контроля (в отличие от плавного перехода из жёлтого воранжевый). При увеличении содержания пероксида водорода в индикаторной системескорость реакции увеличивается, но воспроизводимость результатов измерений резкопадает (табл.
9).Таблица 9Проведение индикаторной реакции окисления ТМБ на силикагелях № 1, 2(P=0,95, n=5).№ силикагеля12УсловияагагВремя перехода, с12,4±0,29,1±2,56,6±0,65,5±0,8sr0,020,270,090,15Цвета переходаГолубой–жёлтый–оранжевыйТаким образом, для дальнейших исследований была выбрана методика а проведенияиндикаторных реакций окисления ОД и ТМБ, катализируемых пероксидазой хрена (табл.7).4.3. Изучение влияния 1– и 2–нафтолов на каталитическуюактивность пероксидазы хрена на силикагелеВлияние нафтолов на кинетику индикаторной реакций ферментативного окисленияОД и ТМБ изучали на силикагеле № 2, так как скорость реакций на этом носителе выше ипереходы окрасок более чёткие и контрастные. Индикаторные реакции в присутствии 0,1мМ нафтолов проводили по методике 2 (разд.
3.4.). Объёмы всех реагентов составили 2мкл.Переходы цветов при введении 2–нафтола не изменились. В реакции окисления ОДнаблюдался переход зелёный–бурый–красный; в реакции окисления ТМБ – голубой–жёлтый–оранжевый. При введении в систему 1–нафтола изменялись переходы окрасок вобеих реакциях: в случае ОД – зелёный–жёлтый–красный, в случае с ТМБ – голубой–жёлто-зелёный–красный.
Это может быть связано с взаимодействием 1–нафтола спромежуточными или конечными продуктами реакции.Несмотря на различный характер влияния 1– и 2–нафтолов на нативную пероксидазу(1–нафтол является вторым субстратом, а 2–нафтол – ингибитором),при проведенииреакций окисления ОД и ТМБ на силикагеле оба соединения замедляют скоростьиндикаторного процесса, то есть действуют как ингибиторы. Можно предположить, чтофункциональные группы носителя вмешиваются в ферментативный процесс и изменяютхарактер влияния фенолов на пероксидазу. Из табл.
10, 11 видно, что 2–нафтол проявляетбольшее ингибирующее действие в реакциях окисления ОД и ТМБ, чем 1–нафтол.При введении в индикаторную систему нафтолов воспроизводимость результатовизмерений ухудшается (особенно в реакции окисления ТМБ). Поэтому в дальнейшем приизучении влияния фенолов в качестве индикаторной использовали реакцию окисления ОДв присутствии пероксидазы хрена.Таблица 10Влияние 1–нафтола на скорость индикаторных реакцийна силикагеле № 2 (P=0,95, n=3).Субстрат Снафтола,ВремямМперехода, с010,3±0,4ОД0,115,8±2,2Переходы окрасок0,04Степеньингибирования I*, %―0,1435Зелёный–жёлтый–красныйsrЗелёный–бурый–красный012,4±1,40,11―Голубой–жёлтый–оранжевый0,115,9±3,10,1922Голубой–жёлтозелёный–красныйТМБ* I=(1–tкр/tэфф)?100%, где tкр и tэфф – время появления конечного продукта окисленияв отсутствие и в присутствии эффектора, соответственно.Таблица 11Влияние 2–нафтола на скорость индикаторных реакцийна силикагеле № 2 (P=0,95, n=3).Субстрат Снафтола,мМ0ОД0,1Времяперехода, с6,3±0,6srПереходы окрасок0,10Степеньингибирования I, %―12,5±0,40,0450Зелёный–бурый–красный08,2±0,90,11―голубой–жёлтый–оранжевый0,112,0±2,40,2032голубой–жёлтый–оранжевыйТМБЗелёный–бурый–красный4.4.
Изучение влияния фенолов на каталитическую активностьпероксидазы хрена на силикагеле.Согласно работе [17] для хроматографического разделения фенолов использовалисиликагель G с толщиной слоя 200 мкм. Поэтому влияние фенолов (резорцин, пирокатехин,гидрохинон, пирогаллол) на скорость пероксидазного окисления ОД изучали на силикагеле№ 1, так как толщина слоя сорбента больше, чем у силикагеля № 2 (160 и 110 мкм,соответственно, табл.
6).При изучении влияния фенолов в интервале концентраций 0,5–36 мМ.накаталитическую активность пероксидазы хрена, индикаторные реакции проводили пометодике 2 (разд. 3.4.); объёмы компонентов индикаторной системы составили 2 мкл, афенолов – 3 мкл согласно методике хроматографического разделения, описанной в работе[17].При концентрации фенолов 0,5–5 мМ переходы окрасок продуктов окисления ОД неменяются, при этом, чем ниже концентрация фенола, тем переходы становятся болеечёткими. При концентрации резорцина 36мМ наблюдается переход окраски зелёный–бурый. Можно предположить, что реакция не доходит до конца и конечный красныйпродукт окисления ОД не образуется. При такой же концентрации пирокатехинаизменяется окраска промежуточного соединения и наблюдается переход зелёный–фиолетовый–красный.
В реакции окисления ОД в присутствии 36мМ раствора пирогаллоланесколько меняется оттенок конечного продукта окисления и наблюдается переход окрасокзелёный–бурый–бледно-розовый. Скорость индикаторной реакции в присутствии 0,5–5мМфенолов контролировали по времени появления красного продукта окисления. Вприсутствии больших концентраций в случае резорцина фиксировали время переходазелёный–бурый, пирокатехина – фиолетовый–красный, в случае пирогаллола – бурый–бледно-розовый, гидрохинона – бурый–красный. Результаты эксперимента приведены втабл. 12.Таблица 12Влияние фенолов на каталитическую активность пероксидазы хрена насиликагеле № 1 (P=0,95, n=5).0,51536Cфенола,мМФенолВ отсутствиефеноловРезорцинПирокатехинГидрохинонПирогаллолt, csrt, csrt, csrt, csr0,050,110,050,0411,3±0,314,9±0,610,9±1,912,7±0,70,030,040,170,0611,5±1,011,6±0,410,9±0,312,7±0,60,090,040,090,0510,5±0,29,6±0,112,5±1,014,6±1,40,020,020,080,106,3±0,49,1±0,58,5±0,910,9±0,512,3±0,5При увеличении концентрации пирогаллола скорость реакции незначительноуменьшается.
Падение скорости индикаторной реакции при введении гидрохинонанаблюдается только при его высокой концентрации (36 мМ). Увеличение скорости реакциив присутствии 36 мМ раствора резорцина можно объяснить тем, что мы фиксировали невремя появления конечного продукта (как при более низких концентрациях), а времяпоявления промежуточного продукта окисления ОД. Отсутствие зависимости скоростиреакции от концентрации пирокатехина может быть связано с его взаимодействием спромежуточным или конечным продуктом окисления ОД с образованием “нового”фиолетового соединения.Как и в случае нафтолов, все изученные фенолы замедляют скорость реакции, тоесть ведут себя как ингибиторы. Напомним, что резорцин также ингибирует нативнуюпероксидазу хрена, а пирокатехин, гидрохинон и пирогаллол являются её вторымисубстратами в реакции окисления ОД.Однозначно сделать вывод о том, какой из изученных фенолов является наиболеесильным ингибитором пероксидазы хрена нельзя, поскольку степень их ингибирования независит линейно от концентраций фенолов (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
