Ферментативное определение фенолов с использованием пероксидазы хрена после их разделения методом тонкослойной хроматографии (1113624)
Текст из файла
Московский государственный университетим. М.В. ЛомоносоваХимический факультетКафедра аналитической химииФерментативное определение феноловс использованием пероксидазы хрена после их разделенияметодом тонкослойной хроматографииКурсовая работастудентки 2XX группыXXXXX X.X.Научные руководители:м.н.с., к.х.н. XXXX X.X.м.н.с., к.х.н. XXXXXXXXX X.X.Преподаватель:доцент, к.х.н. XXXXXXXXX X.X.Москва 2000СодержаниеВведение ........................................................................................................................................3Обзор литературы .......................................................................................................................4Глава 1.
Ферментативное определение фенолов......................................................................4Глава 2. Разделение фенолов методом тонкослойной хроматографии .................................13Экспериментальная часть.........................................................................................................19Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка результатов измерений,методика эксперимента ................................................................................................................193.1. Исходные вещества............................................................................................................193.2.
Посуда и аппаратура ..........................................................................................................213.3. Обработка результатов измерений ...................................................................................213.4.
Методика эксперимента ....................................................................................................22Глава 4. Ферментативный метод определения фенолов сих предварительным разделениемметодом ТСХ .................................................................................................................................234.1. Выбор индикаторной системы..........................................................................................234.2. Проведение реакции пероксидазного окисления ОД и ТМБ на силикагелях..............264.3.
Изучение влияния 1– и 2–нафтолов на каталитическую активность пероксидазыхрена на силикагеле ......................................................................................................................284.4. Изучение влияния фенолов на каталитическую активность пероксидазы хрена насиликагеле ......................................................................................................................................294.5. Разделение фенолов методом ТСХ с последующим проявлением йодом ...................324.6.
Разделение фенолов методом ТСХ с последующим ферментативным проявлением.33Выводы..........................................................................................................................................35Список литературы.....................................................................................................................36ВведениеВ условиях возвращающегося внимания к проблемам охраны окружающей среды,создание безвредных производств, получение экологически чистых продуктов питания всеболее актуальной становится задача разработки простых, высокочувствительных методовопределениябиологически активных неорганических и органических соединений; всёострее встаёт вопрос создания тест-методов, позволяющих быстро, надёжно, с низкимпределом обнаружения (на уровне и ниже ПДК) контролировать содержание вредныхпримесей в объектах окружающей среды.В этих целях весьма перспективно использование ферментативных методов анализа,сочетающих высокую чувствительность с простотой и экономичностью используемойаппаратуры.
Ферментативными методами можно определять сами ферменты, их субстраты,эффекторы. При этом следует отметить, что определение эффекторов ферментовотличается высокой чувствительностью и, следовательно, наиболее перспективно. Болееширокое внедрение в аналитическую практику несколько ограничено недостаточновысокой селективностью этих методов.Улучшение селективности определения эффекторов можно достичь сочетаниемферментативного определения с предварительным хроматографическимразделением,разрабатывая, таким образом, гибридные методы анализа.Цель настоящей работы заключается в разработке тест-метода определения феноловпо их влиянию на каталитическую активность пероксидазы хрена в реакции окисленияарилдиаминовспредварительнымхроматографии (ТСХ).разделениемфеноловметодомтонкослойнойОбзор литературыПолифенолы, фенол и его производные относятся к широко распространённымвысокотоксичным загрязнителям природных объектов [1].
Фенолы содержатся в продуктахкрекинганефтиискусственногоигорючихволокна,синтетическогосланцев,прикаучука,применяютсясозданииновыхввидовповерхностно-активныхпроизводствеполимерныхвеществ,пластмасс,материалов,пластификаторов,стабилизаторов для нефтапродуктов, в качестве исходных реагентов для синтезакрасителей, пестицидов, антиоксидантов для масел и жиров.Несмотря на очистку сточных вод и воздуха на химических предприятиях,фенольные соединения присутствуют в природных объектах.
Фенолы попадают в сточныеводыврезультатесмывовсполейостатковпестицидов.Прихлорированиифенолсодержащих вод с целью их бактерицидной обработки образуются хлорфенолы,которые при окислении превращаются в диоксины − особо опасные канцерогены.Предельно допустимые концентрации фенолов в водах и воздухе варьируют вшироком интервале 0,0005 − 0,05 мг/л и 0,001 − 0,05 мг/м3, соответственно [2].Объекты анализа на содержание фенольных соединений весьма различны.
Имимогут быть питьевые и сточные промышленные воды, воздух производственныхпомещений и атмосферный воздух, выхлопные газы, табачный дым, коксовые и смоляныедистилляты, различные пластические материалы, древесина и продукты питания. В связи сэтим разработка методов определения фенола и его производных остается актуальнойзадачей аналитической химии.Глава 1. Ферментативное определение феноловБлагодаря высокой чувствительности, простоте в использовании и экспрессности,биосенсоры занимают важную роль в мониторинге окружающей среды. Биосенсор − этоиндикаторный электрод, активной частью которого является иммобилизованный фермент, аопределяемое вещество может быть либо его субстрат, либо эффектор.
Разработано иописано большое число биосенсоров для определения органических и неорганическихсоединений с использованием различных ферментов таких как холинэстераза, пероксидаза,тирозиназа.Тирозиназа(полифенилоксидаза)−этоCu-содержащийферментклассаоксидоредуктаз, который катализирует окисление фенолов кислородом воздуха. Влитературе описан ряд работ по ферментативному определению фенолов с использованиемэтого фермента [3−5].Принцип действия биосенсора на основе тирозиназы на примере субстратапирокатехина можно описать следующей схемой 1 [3]:Схема 1В результате реакции (1), катализируемой тирозиназой, из фенолов образуютсясоответствующие хиноны, а на электроде в присутствии протонов происходит обратнаяреакция восстановления до исходного соединения.В работе [3] описан амперометрический биосенсор на основе тирозиназы гриба,позволяющий определять фенол, пирокатехин, п-крезол и допамин. Для иммобилизациитирозиназыпредварительноготовилигельсмешениемопределённыхколичествполивинилового спирта и пологидроксилцеллюлозы.
Аликвоту смеси, полученнойрастворением фермента в геле, наносили на поверхность стеклоуглеродного электрода. Дляполучения механически прочного электрода его выдерживали в течение 12 часов притемпературе −5оС, а затем 1 час при комнатной температуре (15±2)°С. Эту операциюповторяли трижды.Все амперометрические измерения проводили в стандартной трёхэлектроднойизмерительной ячейке, термостатированной при температуре (25±0,1)°С. Рабочимэлектродом являлся стеклоуглеродный диск диаметром 4 мм с иммобилизованным на егоповерхности ферментом, в качестве электрода сравнения использовали хлоридсеребрянныйэлектрод Ag/AgCl (нас.
KСl), а платиновая проволока была вспомогательным электродом.Измерения проводили при −0,2 В в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 6,9)при постоянном перемешивании анализируемого раствора.Кажущуюся активность фермента, иммобилизованного в криогидратную матрицу,определялиспектрофотометрически.Ферментныйэлектродпомещаливкювету,содержащую 2 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,5) и 1⋅10−4 М пирокатехина. Поистечении трёх минут электрод вынимали и измеряли оптическую плотность раствора при380 нм.
При иммобилизации активность фермента была на 22 % выше, чем нативнойтирозиназы.Было показано, что ферментный электрод сохраняет 98 % первоначальнойактивности в течение трёх месяцев при хранении при 4°С в сухом виде. Это позволяетлегко транспортировать электрод.Метрологические характеристики метода приведены в табл.
1.Таблица 1Метрологические характеристики метода определения фенолов сиспользованием биосенсора на основе тирозиназы (P=0,95, n=3)[3].ФенольноесоединениеЛинейный диапазон определяемыхсодержаний, МПредел обнаружения,мкМsrФенол1,0⋅10−6−1,0⋅10−40,100,04Пирокатехи1,0⋅10−7−1,0⋅10−50,020,04п−Крезол1,0⋅10−7−1,0⋅10−50,020,04Допамин1,0⋅10−6−1,0⋅10−40,100,04нОписанэлектрохимическийметодопределенияфенолаипирокатехинасиспользованием тирозиназы гриба, иммобилизованной в пористом геле Al2O3⋅ xH2O [4].Выбор гексацианоферрата (II) Fe(CN)64− в качестве переносчика электроновобусловлен простотой закрепления его на положительно−заряженной матрице Al2O3 вследствие электростатического взаимодействия.Варьируя соотношение Al : H2O в геле, можно получить поры разной величины, чтопозволяет использовать гель как матрицу как для иммобилизации макромолекул фермента,так и для закрепления низкомолекулярных соединений (Fe(CN)64−).Принцип действия электрода можно отобразить схемой 2:Схема 2Схематическистроениеферментногоэлектродаможноизобразитьтак:стеклоуглерод / гель Al2O3− Fe(CN)64− (внутренний слой) / гель Al2O3 −тирозиназа(внешний слой).Для приготовления геля Al2O3 изопропоксид алюминия Al(i−PrO)3 растворяли вдистиллированной воде.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
