Ферментативное определение фенолов с использованием пероксидазы хрена после их разделения методом тонкослойной хроматографии (1113624), страница 6
Текст из файла (страница 6)
13).Таблица 13Степень ингибирования пероксидазы хрена фенолами в реакции окисления ОДна силикагеле № 1.Сфенола,мМ0,51536ФенолРезорцин31444540Пирокатехин26584634Гидрохинон42424250Пирогаллол49505057При этом можно отметить, что наибольшее ингибирующее действие на ферментоказывает пирогаллол.Таким образом, при введении фенолов в реакцию окисления ОД, катализируемуюпероксидазой хрена, на силикагеле скорость реакции уменьшается. Значит даннуюиндикаторнуюсистемуможноиспользоватьингибирующему действию на пероксидазу хрена.дляопределенияфеноловпоих4.5.
Разделение фенолов методом ТСХ с последующим проявлениемйодомНа основании литературных данных [17] было проведено разделение смесейизученных фенолов на пластинах силикагеля № 1 с использованием трёх систем элюентов:(I) хлороформ–метанол–уксусная кислота (90:10:1);(II) хлороформ–этилацетат–уксусная кислота (50:50:1);(III) толуол–ацетонитрил–муравьиная кислота (70:30:1).Для расчёта Rf хроматограммы проявляли в парах спиртового раствора йода.Были разделены фенолы с различной концентрацией: 0,1 мМ, 5 мМ, 36 мМ.На хроматограмму на линию старта наносили в отдельные точки по 3 мкл растворовфенолов и в четвёртую точку их смесь в эквимолярных соотношениях. Таким образом, длякаждого соединения получали два значения Rf – индивидуальное и при разделении смеси.Для выбора системы элюента провели хроматографическое разделение фенолов(С=36мМ).
Работу проводили по методике 3 (разд. 3.4.). Результаты разделения в сравнениис литературнами данными [17] приведены в табл. 14.Таблица 14Результаты разделения фенолов (С=36мМ) на силикагеле № 1 (Р=0,95, n=3).ЭлюентФенолIЛитер.данныеIIЭксперим. данные36 мМ5 мМIIIЛитер..данныеЭксперимданныеЛитер Эксперим.даннданныеыеПирогаллол0,200,39±0,010,53±0,050,510,54±0,020,510,44±0,01Резорцин0,270,56±0,020,53±0,020,620,68±0,010,600,55±0,01Пирокатехин0,420,73±0,010,67±0,050,650,72±0,020,670,60±0,01Отличие значений экспериментально рассчитанных Rf от литературных данныхможно объяснить различием используемых силикагелей и толщины слоя сорбента.Rf гидрохинона при разделении элюентом (I) равен 0,51±0,03.Показано, что наибольшая эффективность разделения фенолов достигается прииспользовании элюента хлороформ–метанол–уксусная кислота (90:10:1).Хроматограммы, полученные при разделении фенолов при их концентрации 0,1 мМпарами спиртового йода не проявлялись, так как предел обнаружения данным способомсоставляет 2 мкг [17], а наносимое количество фенола составляло 0,04 мкг, то есть мы немогли рассчитать значкнее Rf.Таким образом, показана возможность тонкослойного разделения фенолов насиликагеле № 1 и рассчитаны значения Rf при использовании различных подвижных фаз.Для ферментативного определения фенолов была выбрана смесь элюента (I) иконцентрация фенолов 5 мМ, поскольку при большей концентрации фенолов изменяютсяцвета переходов.4.6.РазделениефеноловметодомТСХспоследующимферментативным проявлениемДля ферментативного определения фенолов (резорцин, пирогаллол, пирокатехин)пластинку после хроматографического разделения сушили для испарения растворителя.Работу проводили согласно методике 4 (разд.
3.4.). Растворы фталатного буфера,пероксидазы хрена, ОД и пероксида водорода наносили в одну точку, рассчитанную поэкспериментально определённым Rf при этих условиях (Сфенолов=5мМ, элюент I). Длярасчета степени ингибирования фенолов на “свободном” месте хроматографическойпластинки проводили контрольный опыт, учитывая таким образом влияние растворителейна скорость окисления ОД.
Время контрольного опыта составило 5,2±0,6 с (sr=0,12).Также на “свободном” месте этой же пластинки проводили реакцию окисления ОДпри индивидуальном присутствии резорцина, пирогаллола и пирокатехина. Для контроляскорости реакции в отсутствие и в присутствии фенолов фиксировали время появленияярко-красного продукта окисления при переходе зелёный–коричневый–красный.
Отметим,что все наблюдаемые переходы окраски были очень чёткими и контрастными. Результатыопределения фенолов приведены в табл. 15.Таблица 15Ферментативное определение фенолов после их хроматографическогоразделения на силикагеле.Определение фенолов после ТСХФенолВремяперехода, сСтепеньингибирования, %В отсутствиефенолаПроведение реакции на носителепосле ТСХ в присутствии феноловВремяперехода, сСтепеньингибирования, %5,2±0,6Резорцин9,4±1,0398,0±0,535Пирогаллол11,8±2,0528,2±0,637Пирокатехин8,7±1,83410,4±0,850Как видно из табл. 15 степень ингибирования фенолами при проведении реакции вточках, соответствующих зонам разделяемых фенолов и на “свободных” местах сильноразличаются для пирогаллола и пирокатехина.
Это свидетельствует о необходимостидальнейшей оптимизации условий разделения (изменение состава подвижной фазы,методики нанесения и аликвот смесей) и проведения индикаторной реакции (варьированиерН, концентраций компонентов реакции). Такое детальное исследование необходимо дляразработки чувствительного количественного тест–метода определения фенолов после иххроматографического разделения.Таким образом, детектирование фенолов после их тонкослойного разделения насиликагеле можно проводить, используя реакцию окисления ОД, катализируемуюпероксидазой хрена.Выводы1.
Собрана и изучена литература по ферментативным методам определения фенолови методам их тонкослойного хроматографического разделения.2. Для проведения реакции окисления о–дианизидина и тетраметилбензидина,катализируемых нативной пероксидазой хрена, на силикагеле выбраны сорбенты наалюминиевой подложке СТХ–1ВЭ и СТХ–1А фирмы “Полисорб” (Краснодар).3. Установлено, что пирокатехин, резорцин, гидрохинон, пирогаллол и 1–,2–нафтолыингибируют каталитическую активность пероксидазы хрена в реакции окисления о–дианизидина и тетраметилбензидина на выбранных силикагелях.4. Проведено разделение фенолов методом тонкослойной хроматографии насиликагеле СТХ–1ВЭ с использованием трёх подвижных фаз.5. Показана возможность ферментативного определения фенолов после ихразделенияметодомтонкослойнойиспользованием пероксидазы хрена.хроматографиинасиликагелеСТХ–1ВЭсСписок литературы1. Коренманн Я.
И. Ароматические соединения – экоаналитические проблемы.//Соросовский Образовательный Журнал. 1999. №12. С.35–39.2. Беспамятников Г. П., Кротов Ю. А. Предельно допустимые концентрациихимических веществ в окружающей среде. 1985. Л.:Химия. 528 с.3. Deng Q., Guo Y., Dong S., // Anal. Chim. Acta.1996. V.319. №1. P. 71-77.4. Liu Z, Deng G., Li D. //Anal. Chim. Acta.
2000. V. 407 №1. P. 87-96.5. Cosnier S., Popescu I. C. //Anal. Chim. Acta. 1996. V. 319. № 1. P. 145-151.6. Zhao S., Luong J. // Anal. Chim. Acta. 1996. V. 327. P. 235-242.7. Шеховцова Т. Н., Лялюлин А.А., Кондратьева Е. И., Газарян И. Г., ДолмановаИ.Ф., // Журн. аналит. химии. 1994. Т. 49. № 12. С. 1317-1323.8. Багирова Н. А., Шеховцова Т. Н., Табатчикова Н. В., ван Хьюсти Р. Б.// Журн.аналит. химии. 2000. Т. 55.
№ 1. С. 93-101.9. Веселова И. А. // Иммобилизованные пероксидаза и щелочная фосфотаза в тест–методах определения биологически активных веществ. Дисс. К. х. н. М..:МГУ. 2001. 295 с.10.Shekhovtsova T. N., Muginova S. V., Bagirova N. A. // Mendeleev Commun. 1997. P.119-120.11. Волынец М. П., Гурьева Р. Ф., Дуброва Т. В.,Мясоедов Б. Ф.,Саввин С. Б. //Журн. аналит. химии. 1991.
Т. 46. №8. С. 1591-1595.12. Шмаков В. С., Зеленова Л. М., Ильясова А. И., Бродько А. С., Латыпова Ф.Н.,Рахманкулов Д. Л. // Журн. прикл. химии. 1996. Т. 69. №4. С. 598-601.13. Fisher W., Bund O., Hauck H. E. // Fresenius J. Anal. Chem. 1996.
V. 354. №718. Р.889-891.14. Sherma J.,Boldnieks J. // J. Liquid chromatogr. 1990. V. 13. №20. P. 3941-3947.15. TLC Application Cat. Macherly-Nagel. 1995. P. 51-53.16. Lerpi L., Desideri P. G., Heimler D. // J. Chromatogr. 1982. V. 248. P. 308.17. Sharma O. P., Bhat T. K.,Singh B.
// J. Chromatogr. A. 1998. V. 822. P. 167-171.18. Shannon L. M., Kay E., Lew J. Y. // J. Biol. Chem. 1966. V. 249. №9. P. 2166-2172.19. Claiborne A., Fridovich J. // Biochemistry. 1979. V. 18. №11. P. 2324-2329.20. Josephy P. D., Eling T., Mason R.P. // J. Biol. Chem.
1982. V. 257. №7. P. 3669-3675..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
