Ферментативное определение фенолов с использованием пероксидазы хрена после их разделения методом тонкослойной хроматографии (1113624), страница 2
Текст из файла (страница 2)
После перемешивания раствора в течение 45−60 минут добавляли1,0 М HСl. Полученную смесь нагревали в течение 16 часов при 90°С с открытой крышкойдля испарения изопропанола i−PrOH.Поверхность стеклоуглеродного электрода, являющегося основой ферментногоэлектрода, тщательно полировали бумагой с напылением алмаза и частиц алюминия,последовательно промывали деионизованной водой, азотной кислотой (1 : 1), ацетоном исушили на воздухе.На поверхность электрода наносили гель Al2O3 (соотношение Al : H2O равно 1 : 100),содержащего 50 ммоль/л Fe(CN)64− и сушили в течение часа.
Для иммобилизациитирозиназы 10 мкл коллоида, полученного смешением геля Al2O3 (1 : 200) и 0,1 мл/млраствора тирозиназы, наносили вторым слоем на электрод и сушили в течение суток прикомнатной температуре. Полученный электрод промывали фосфатным буфернымраствором (рН 7,4).Амперометрические измерения проводили в электрохимической ячейке, содержащей2 мл 0,02 М фосфатного буфера (рН 7,4) при постоянном перемешивании. Оптимальнымрабочим потенциалом был выбран −0,16 В (относительно насыщенного каломельногоэлектрода (НКЭ)) при температуре 25,0±0,1°С.Линейный диапазон определяемых содержаний фенола данным методом составляет1,0⋅10−7 − 2,5⋅10−4 М, предел обнаружения фенола − 50 нМ.Электрод сохраняет активность в течение месяца при хранении при 4°С.Для повышения чувствительности ферментативного определения фенола присоздании биосенсора использовали два биокатализатора: тирозиназу гриба и пероксидазухрена.
Благодаря более высокой активности и меньшей молекулярной массы пероксидазыхрена по сравнению с тирозиназой, процесс окисления пирокатехина до о−хинона,катализируемый пероксидазой в присутствии Н2О2 более вероятен, чем этот же процесс,катализируемый тирозиназой. Вследствие этого процесс окисления ускоряется, а значит иуменьшается время отклика электрода.Для изготовления биосенсора аликвоту водного раствора, содержащего ферменты,наносили на стеклоуглеродный электрод (диск диаметром 3 мм) и под давлением удаляливоду. Полученный адсорбированный ферментный слой полимеризовали в течение 30 минутпри потенциале электролиза 0,76 В (отн.
НКЭ) в 0,1 М водном растворе LiClO4. Измерениесилы тока проводили в трёхэлектродной электрохимической ячейке при −0,2 В (отн. НКЭ),термостатированной при 25±0,1°С. Платиновая проволока и НКЭ служили измерительнымэлектродом и электродом сравнения, соответственно. В измерительную ячейку помещали10,0 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 6,5), содержащего фенол и пероксидводорода. Было показано, что наибольшая чувствительность сенсора достигается приотношении массовых долей ферментов в электроде тирозиназа : пероксидаза 1 : 3 исодержании Н2О2 0,5 мМ.Двухферментный электрод оставался стабильным в течение четырёх недель прихранении сухим при −18°С.Предел обнаружения фенола данным методом составляет 2 нмоль/л (sr = 0,03).Новыйэлектрокаталитическийподходсиспользованиемпредварительногохимического модифицирования фенолов и ферментативной раакции был использован дляопределения ряда хлорфенолов с использованием глюкозооксидазы [6].Хлорфенолы окисляли до хлорбензохинонов сульфатом церия в водном растворе,содержащем 2−5 % 2−гидроксипропил−β−циклодекстрина, который образует растворимыекомплексы с водонерастворимыми соединениями.
Окисление проводили в фосфатномбуфере (рН 6,5).Также окислить хлорфенолы можно с помощью пероксида водорода в присутствиихлорпероусидазы как катализатора. В этом случае реакцию проводили в 0,05 М тартратномбуфере (рН 3,0), содержащем 2−5 % 2−гидроксилпропил−β−циклодекстрина.Было показано, что бензохиноны (А) являются эффективными электрохимическимимедиаторами переноса электронов в системе глюкозооксидаза − глюкоза, так как онирегенирируют восстановленную глюкозооксидазу до её активного окисленного состояния,обеспечивая перенос электронов от фермента к электроду.Принцип действия электрода можно изобразить следующей схемой 3 :Схема 3Глюкозооксидазу иммобилизовали на стеклоуглеродном электроде в присутствииглутарового альдегида.
Измерение тока проводили в трёхэлектродной ячейке припотенциале 0,43 В (отн. Ag/AgCl) в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 5,0).Хранили электрод при 4°С в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0).Разработанный биосенсор позволяет селективно определять 2,4,6−трихлорфенол вприсутствии других хлорфенолов. Предел обнаружения этого соединения уникальнонизкий, равен 1,5 нМ. Для других моно−, би− и трихлорпроизводных фенола пределобнаружения составляет 10−20 мМ.В описанных выше индикаторных системах [3−6] определяемые фенолы являлисьсубстратами ферментов. Как правило, определение соединений, являющихся эффекторамиферментов отличается большей чувствительностью по сравнению с чувствительностьюопределения субстратов.В настоящее время известны работы по использованию пероксидаз различногопроисхождениядляферментативногоопределенияфенолов−эффекторовэтихбиокатализаторов.Пероксидаза − фермент, относящийся к классу оксидоредуктаз, содержитпростетическую группу (гемин) и катализирует окисление ряда органических инеорганических восстановителей перекисными соединениями.В работах [7,8] в качестве индикаторной была выбрана реакция окисленияо−дианизидина пероксидом водорода, катализируемая нативной пероксидазой.
Скоростьиндикаторной реакции контролировали спектрофотометрически по нарастанию оптическойплотности вследствие образования окрашенного продукта реакции окисления (λмах = 460нм).Известно, что пероксидазы, выделенные из различных источников− арахиса, корнейхрена, клеток люцерны Medicago Savita, ксилотрофного гриба Phellinius Igniarius, несмотряна определённую гомологию строения, имеют различия в их аминокислотном составе,термостабильности, субстратной специфичности, каталитических свойствах. Однако,характер влияния фенолов на нативные пероксидазы различного происхожденияаналогичен, а изученные фенолы [7,8] можно разделить на 2 группы : ингибиторы и вторыесубстраты пероксидаз.В присутствии ингибиторов наблюдается понижение скорости индикаторнойреакции, прямо пропорциональное концентрации фенолов в реакции.
К этой группеотносятся фенол, резорцин, 2−нафтол, 2− и 4−бромфенолы, 2,6− и 3,4− диметилфенолы,пентабромфенол и 4−хлорфенол. В присутствии вторых субстратов пероксидазнакинетических кривых возникает индукционный период, продолжительность которогопропорциональна концентрации соответствующего фенола в реакции. Ко вторымсубстратам относятся пирокатехин, гидрохинон, пирогаллол, 1−нафтол и 2− и 4−аминофенолы.Было установлено [8], что характер влияния фенолов на скорость индикаторногопроцессаопределяется,главнымсвойствами : фенолы, обладающиеобразом,ихокислительно−восстановительнымиокислительно−восстановительным потенциаломменьшим, чем потенциал основного субстрата − о−дианизидина, являются вторымисубстратами в данной индикаторной реакции.
В течение индукционного периодапроисходит окисление фенолов, и лишь после его завершения начинантся окислениео−дианизидина; при этом оптическая плотность раствора возрастает, так как скоростьиндикаторной реакции контролируют по продукту окисления основого субстрата. Наклонвторого восходящего участка кинетической кривой в присутствии фенолов несколько ниже,чем в их отсутствие, что связано с частичным расходом пероксида водорода на окислениефенолов.Фенолы, обладающие большим окислительно−восстановительным потенциалом, чемпотенциал о−дианизидина, оказывают ингибирующее действие на фермент и в ихприсутствии индукционный период отсутствует, понижается скорость индикаторнойреакции.Таким образом, при определении фенолов−ингибиторов и фенолов−вторыхсубстратов следует использовать разные аналитические сигналы − либо скоростьиндикаторнойреакции(тангенсугланаклонакинетическойкривой),либопродолжительность индукционного периода, соответственно.Установлено, что для определения фенолов (резорцин, гидрохинон, пирогаллол)можно использовать все изученные пероксидазы.
Из них наиболее чувствительными кдействию фенолов являются пероксидазы арахиса и гриба. Чувствительность вопределении фенолов в зависимости от источника пероксидазы уменьшается в рядуарахис– ксилотрофный гриб − хрен − люцерна. Результаты определения ряда феноловприведены в табл. 2.Таблица 2Метрологические характеристики методик определения фенолов сиспользованием пероксидазы арахиса (I) и хрена (II) (P=0,95, n=3).Линейный диапазон концентраций,мкМИнгибиторыСH, мкМsrРезорцин1−101,10,192−Нафтол1−251,20,202−Бромфенол5−5050,202,6−Диметилфенол3−2530,203,4−Диметилфенол25−100250,23Резорцин1−105,40,17ФенолIIIВторые субстратыIIIПирокатехин3−7,530,08Пирогаллол0,5−2,50,50,151−Нафтол0,5−50,50,202−Аминофенол0,5−2,50,50,054−Аминофенол1−510,05Гидрохинон5−504,50,12Пирогаллол1−100,610,30Установлено, что индивидуальное определение резорцина и гидрохинона при иходновременном присутствии возможно при соотношениях их концентраций 2 : 1 − 6 :1, а вслучае одновременного присутствия 1− и 2− нафтолов − при соотношениях 1 : 1 − 1 : 10 [8].Для создания тест–метода определения фенолов по их действию на каталитическуюактивность пероксидазы, изученному и описанному в работах [7,8], пероксидазу хренаиммобилизовали в природном полисахариде –хитозане на пенополиуретане (ППУ) [9].В качестве индикаторной использовали реакцию пероксидного окисления о–дианизидина.
Скорость индикаторной реакции контролировали визуально (при этомнаблюдали переход окрасок (зелёный–бурый–красный) и характеризовали временемпоявления конечного продукта окисления. Было установлено, что фенол, резорцинзамедляют ферментативное окисление о–дианизидина, то есть как и в случае реакции врастворе [7,8], являются ингибиторами фермента. В присутствии этих соединенийувеличивается время появления конечного продукта окисления.Как было сказано ранее, при введении пирокатехина, гидрохинона или пирогаллолавиндикаторнуюреакциюнакинетическихкривыхокисленияо–дианизидина,катализируемого нативным ферментом, наблюдается индукционный период и эти фенолыявляются вторыми субстратами [7,8].
При проведении индикаторной реакции на ППУ вприсутствии этих соединений зелёный прдукт не образкется. В этом случае при протеканииреакции наблюдается переход розовый–бурый–красный. Время появления красной окраскиувеличивается с повышением концентрации фенолов.Кроме того, было показано, что о– и п–нитрофенолы, не влияющие накаталитическуюактивностьнативнойпероксидазыхрена,ингибируютфермент,иммобилизованный на ППУ.На основании полученных данных были разработаны ферментативные тест–методыопределения фенолов, позволяющие определять эти соединения в природных водах науровне ПДК (Сн 1–25 мкМ).Была изучена возможность индивидуального определения фенолов (изомеров,оказывающих разное действие на скорость индикаторного процесса) при совместномприсутствии.Дляповышенияселективностиопределенияфеноловследуетсочетатьферментативный метод с предварительным их разделением.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
