Ферментативное определение фенолов с использованием пероксидазы хрена после их разделения методом тонкослойной хроматографии (1113624), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработкарезультатов измерений, методика экспериментаЧувствительность ферментативных методов, как и других каталитических методованализа, ограничивается тем, что почти всегда наряду с каталитической протекаетнекаталитическая реакция, создающая фон. Колебания фона вызываются наличием вреактивах и воде примесей, влияющих на скорость некаталитической реакции,изменениями температуры и т.д.
Чувствительность можно значительно повысить с однойстороны, за счёт использования процессов с максимально различающимися константамискоростей каталитической и некаталитической реакций, а с другой − за счёт стабилизации“фона”. Колебания “фона” можно свести до минимума, применяя реактивы, воду и посудувысокой чистоты, а также строго стандартизируя условия проведения эксперимента.При работе с ферментами и малыми количествами веществ, для оценкидостоверности результатов, полученные данные необходимо обрабатывать с применениемметодов математической статистики.
Это позволяет объективно оценить диапазонопределяемых содержаний веществ, правильность и воспроизводимость метода.3.1. Исходные веществаВ работе использовали твёдый препарат пероксидазы из корней хрена (К.Ф. 1.11.1.7)(“Sigma”, США), Rz=2,2 , активность по о-дианизидину − 75 уд. ед. на 1 мг фермента.Растворы с содержанием пероксидазы n×10-5 М готовили растворением навесок твёрдогопрепарата в боратном буферном растворе (pH 7,0), содержащем 20 об.% 0,1 М растворанитрата натрия для поддержания постоянной ионной силы и повышения устойчивостифермента.Точнуюконцентрациюраствораферментаустанавливалиспектрофотометрически (ε403=9,4×104 моль-1см2[18]).Растворысменьшимсодержаниемпероксидазыготовилиежедневнонепосредственно перед работой разбавлением исходного раствора боратным буфернымраствором (pH 7,0).
Твёрдые препараты и растворы фермента хранили в холодильнике при4°С.Боратный буферный раствор (pH 7,0) готовили смешением 0,05 М растворатетрабората натрия (х.ч.), дважды перекристаллизованного из воды, и 0,2 М раствораборной кислоты (ос.ч.) в объёмном соотношении 1:19.Фталатный буферный раствор (pH 5,0) готовили смешением 0,1 М растворабифталата калия (х.ч.), дважды перекристаллизованного из воды, и 0,1 М растворагидроксида калия (ос.ч.) в объёмном соотношении 5:2.0,1 М раствор нитрата натрия готовили растворением точной навески препарата(ос.ч.) в воде.В работе применяли 8,6 М раствор пероксида водорода (“Merck”, Германия).Точную концентрацию раствора устанавливали перманганатометрически.
Растворы сменьшим содержанием пероксида водорода готовили ежедневно разбавлением водойисходного раствора.В работе использовали твёрдые препараты о-дианизидина (ОД) (х.ч.), дваждыперекристаллизованного из этанола-ректификата, и 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ)(“Sigma” , США). Растворы ОД и ТМБ готовили растворением их точных навесок вэтаноле-ректификате.В работе использовали твёрдые препараты пирокатехина, резорцина, гидрохинона,пирогаллола, 1−и 2−нафтолов (х.ч.) (“РЕАХИМ”, Россия), очищенные перекристаллизациейиз этанола−ректификата или возгонкой. Растворы с содержанием фенолов n×10–2 Мготовили растворением навесок твёрдых препаратов в метаноле (этаноле–ректификате), арастворы с меньшим содержаниеи готовили разбавлением исходного раствора метанолом(водой).
Растворы фенолов готовили ежедневно.В работе использовали мувавьиную кислоту, уксусную кислоту, метанол, этанол–ректификат, хлороформ, этилацетат, толуол (ос.ч., “Раахим”, Россия). Для проявления нахроматограмме использовали спиртовой раствор йода.Для приготовления всех водных растворови перекристаллизации реагентовиспользовали деионизованную воду, очищенную на установке “Milipore” (Франция).В качестве сорбентов использовали силикагели, закреплённые на алюминиевых илиполимерных подложках (“Полисорб”, Россия).Характеристики пластин силикагелейприведены в табл. 6.Таблица 6Характеристики пластин силикагелей.№ пластиныМатериал подложкиЗернение, мкм1МаркасиликагеляСТХ–1ВЭАлюминий8–12Толщинаслоя, мкм1602СТХ–1ААлюминий8–121103СТХ–1ВЭПолиэтилентерефталат8–121103.2.
Посуда, аппаратураПри определении ультрамалых количеств веществ большое внимание следуетуделять материалу и чистоте используемой посуды.В работе использовали стеклянные пробирки и мерные колбы с притёртымипробками, Которые предварительно очищали концентрированной перегнанной азотнойкислотой, обрабатывали паром в тачение 10–15 минут и тщательно промывалидистиллированной и деионизованной водой.Точнуюконцентрациюрастворапероксидазыхренаопределялинаспектрофотометре “Shimadzu” UV–2201 (Япония) (l=1 см, λ=403 нм).рНбуферныхрастворовизмерялинарН–милливольтметре“Эксперт–001”(“Эконикс–эксперт”, Россия).Для отбора определённых объёмов реагентов применяли микродозаторы “BIOHIT”(Финляндия).3.3. Обработка результатов измеренийРезультаты измерений обрабатывали с применением методов математическойстатистики, применяя следующие обозначения:х – средняя для ряда из n значений,V – дисперсия,s – стандартное отклонение,sr – относительное стандартное отклонение,3.4.
Методика экспериментаМетодика 1: проведение индикаторной реакции на силикагелеПоскольку в процессе пероксидазного окисления ОД и ТМБ образуютсяокрашенные продукты, скорость реакции контролировали визуально.На силикагель в одну и ту же точку микродозатором последовательно наносилинеобходимые объёмы фталатного буферного раствора (рН 5,0), 0,5 мкМ растворапероксидазы хрена, 5 мМ раствора субстрата (ОД или ТМБ) и 10 мМ раствора пероксидаводорода.
В момент введения в индикаторную систему последнего компонента включалисекундомер и фиксировали время появления окраски конечного продукта окисления.Методика 2: проведение индикаторной реакции на силикагеле в присутствиифеноловДля изучения влияния фенолов на реакции окисления ОД и ТМБ, катализируемыхпероксидазой, на пластину силикагеля наносили 2–3 мкл раствора фенола и сушили навоздухе в течение 30 с для удаления растворителя. Далее в эту же точку последовательнонаносили все растворы и фиксировали скорость реакции, как указано в методике 1.Методика 3: разделение смеси фенолов методом ТСХ на силикагелях ипроявление спиртовым раствором йода.Для разделения смеси фенолов на силикагеле использовали три системы элюентов[17]:(I) хлороформ–метанол–уксусная кислота (90:10:1);(II) хлороформ–этилацетат–уксусная кислота (50:50:1);(III) толуол–ацетонитрил–муравьиная кислота (70:30:1).Объём подвижной фазы составил 6 мл.
Смесь растворителей готовили вхроматографическом стакане непосредственно перед разделением.Для хроматографирования использовали пластины силикагеля размером 3,7см×10см.На пластинке проводили две линии: линию старта на расстоянии 1 см от края и линиюфронта растворителя на расстоянии 0,5 см от противоположного края.
Проведение линиифронта растворителя до хроматографирования связано с затруднением фиксации фронтарастворителяпослехроматографирования,обусловленнымвысокойлетучестьюкомпонентов подвижной фазы.Разделяемые растворы фенолов наносили на линию старта, высушивали ипогружали пластину в стакан с подвижной фазой, закрывали притёртой крышкой.Хроматографирование проводили до достижения растворителем отмеченной линии фронта.Пластину высушивали на воздухе для испарения растворителей.Для проявления зон фенолов пластину 15–20 минут выдерживали в эксикаторе соспиртовым раствором йода.Методика 4: разделение смеси фенолов методом ТСХ на силикагелях споследующим ферментативным проявлением.Разделение фенолов проводили согласно методике 3, используя в качествеподвижной фазы систему I.
Для ферментативного детектирования фенолов в определённыеточки на поверхности пластинки, рассчитанные по ранее установленным для них Rf,микродозатором последовательно наносили 2 мкл раствора фталатного буферного раствора(рН 5,0), 2 мкл 0,5 мкМ раствора пероксидазы хрена, 2 мкл 5 мМ раствора ОД и 2 мкл 10мМ раствора пероксида водорода.
В момент введения в индикаторную систему последнеговключали секундомер, визуально контролировали изменение окраски на поверхностисиликагеля и фиксировали время появления окраски конечного продукта реакции.Контрольный опыт проводили на “свободном” месте этой же пластинки, такимобразом учитывая влияние растворителя подвижной фазы на скорость индикаторнойреакции.Глава 4. Ферментативный метод определения фенолов сихпредварительным разделением методом ТСХ4.1.
Выбор индикаторной системыКак было сказано в обзоре литературы, ранее был разработан тест–методселективного ферментативного определения Hg(II), метил–, этил–, фенилртути в сочетаниис их предварительным разделением методом ТСХ на силикагеле “Silufol” [10]. В качествеиндикаторной использовали реакцию окисления ОД пероксидом водорода, катализируемуюпероксидазой хрена. Кроме того, эту же индикаторную реакцию, я также реакциюокисления ТМБ, катализируемую пероксидазой хрена, иммобилизованной на силикагеляхфирмы “Полисорб” (Краснодар), использовали в тест–методе определения микроколичествHg(II).В литературе [17] описан метод разделения ряда фенолов и фенольных соединений(в том числе, для которых были разработаны тест–методы определения с использованиемпероксилазы хрена, иммобилизованной на ППУ [9]) на силикагеле G.Таким образом, на основании литературных данных для разработки гибридногометода определения фенолов в качестве индикаторной реакции нами были выбраныреакции пероксидазного окисления ОД и ТМБ, а в качестве неподвижной фазы–силикагелифирмы “Полисорб”.
Также следует отметить, что кинетика и механизм выбранных реакцийхорошо изучены и описаны в литературе.Согласно данным работы [19], при значениях рН, близких к нейтральным, окислениеОД, катализируемое нативной пероксидазой хрена, протекает по схеме 4. Окисление ОДпротекает через образование соединения зелёного цвета (схема 4, соединение I), которомубыла приписана мерихиноидная структура (λmax=386 и 704 нм).
Стабильным продуктомокисленияОДявляетсябис(3,3?–диметокси–4,4?–амино)азобифенилхинондиимина,образующийся при конденсации двух молекул хинондиимина и окрашенный в буро–коричневый цвет (λmax=453–475 нм).При изучении химизма окисления ТМБ, катализируемого нативной пероксидазойхрена, было установлено, что продуктом одноэлектронного окисления является катион–радикал (схема 5), который находится в равновесии с мерихиноидным комплексом,окрашенным в голубой цвет (λmax= 375 и 655 нм) [20]. Конечным продуктом окисленияТМБ является хинондиимин, окрашенный в жёлтый цвет с максимумом поглощения при465 нм.При изучении процессов окисления ОД и ТМБ, катализируемых пероксидазой,иммобилизованной на силикагеле, визуально наблюдали переходы окрасок зелёная–бурая–красная и голубая–зелёная–жёлтая, соответственно [9].Следует отметить, что переходы окрасок в реакциях окисления ОД и ТМБ,катализируемых пероксидазой хрена, иммобилизованной на силикагеле, практическисовпадают с изменениями окраски в тех же реакциях, катализируемых гативнойпероксидазой.Таким образом, в качестве индикаторных систем были выбраны реакциипероксидазного окисления ОД и ТМБ, проводимые на силикагелях.4.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
