Ферментативное определение фенолов с использованием пероксидазы хрена после их разделения методом тонкослойной хроматографии (1113624), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В работе [10] был разработанселективный ферментативный тест–метод определения Hg (II) и ртутьорганическихсоединений в сочетании с их предварительным разделением методом ТСХ. Низкаячувствительность тест–метода объясняется тем, что для усиления ингибирующего действияHg (II), а также для оказания действия ртутьорганических соединений на пероксидазу хренанеобходимовведениевреакциюокисленияо–дианизидинадополнительногосеросодержащего ингибитора – тиомочевины и фенилтиомочевины, соответственно.Этоприводиткдополнительномуусложнениюмногокомпонентнойферментативнойиндикаторной системы.
Поскольку фенолы изменяют кинетику пероксидазного окисленияо–дианизидина при низких концентрациях, мы сочли целесообразным применитьпредложенный в работе [10] гибридный метод для разработки тест–метода определенияфенолов.Глава 2. Разделение фенолов методом тонкослойной хроматографииК плоскостным видам хроматографии относят бумажную (БХ) и тонкослойную(ТСХ). Эти два вида жидкостной хроматографии просты по технике выполнения,экспрессны, не требуют дорогостоящего оборудования. Разделение этими методами можетбыть выполнено с использованием различных хроматографических систем, поэтомувыделяют адсорбционную, распределительную, обращённо-фазовую и ионообменную БХ иТСХ.
Тонкослойную хроматографию используют чаще, чем бумажную [11].Количественный анализ осуществляют непосредственно на хроматограмме (на слоесорбента или на бумаге) или анализируемое вещество (пятно) вымывают из слоя сорбента(с бумажной полоски) после вырезания зоны, и полученный раствор анализируют какимлибо методом.Непосредственно на хроматограммах количественный анализ можно осуществлятьпо размеру пятна (полуколичественное определение), спектрофотометрическим методом поспектрампоглощения(фотоденситометрия)ипоспектрамотражения,атакжефлуориметрическим, рентгенофлуоресцентным и радиометрическим методами.Реализацияанализируемойхромато−фотометрическогопробынатонкийслойметодасорбента,заключаетсяввпоследующемнанесениипроведениихроматографического процесса, приводящего к концентрированию или разделениюопределяемых элементов, в обработке (опрыскивании) сорбционного слоя растворамиорганических реагентов, образующих с определяемыми элементами ярко окрашенные зонына хроматограмме [11].
В отдельных случаях в качестве подвижной фазы прихроматографированииокрашенныеиспользовалисоединенияснепосредственноопределяемымрастворыэлементом.Вреагента,такихслучаяхдающегореагентиспользовался как для разделения (благодаря различию в подвижности его окрашенныхкомплексных соединений с элементами), так и для определения зон элементов нахроматограмме без дополнительной обработки.
Кроме того, возможно проведениекапельной реакции на хроматографической пластинке с образованием окрашенныхпродуктов после разделения компонентов смеси.В работе [12] описана методика синтеза высокоэффективных полиамидныхсорбентов на основе отечественных промышленных полиамидов поликапролактама ПА−6 иполигексаметиленсебацинамина ПА−610 для разделения фенолов методом тонкослойнойхроматогрофии.Порошки сорбентов получали растворением промышленных полиамидов вконцентрированной соляной кислоте и последующим осаждением из раствора смесьюэтанол − вода (1 : 1). Ддя получения носителя для ТСХ суспензию полиамидного порошка вэтаноле закрепляли на стеклянных пластинках (толщина слоя 0,3 мм) с использованиемкрахмального клейстера.Изученавозможностьхроматографическогоразделениясмесифеноловнаполученных сорбентах.
В качестве элюентов использовали воду и 50 %−ный растворэтанола. Результаты разделения (Rf) приведены в табл. 3.Таблица 3Результаты хроматографического разделения смеси фенолов (Rf) наполиамидах.ЭлюентФенолВодаЭтанол (50 %)ПА − 6ПА − 610ПА − 6ПА − 610Фенол0,180,140,590,55Пирокатехин0,290,250,500,51Резорцин0,150,130,450,49Пирогаллол0,390,310,610,56Близкие значения Rf не позволяют разделить все четыре изучаемых фенола напредложенных сорбентах. Эффективно можно разделить смесь двух или трёх соединений.В работе не приведены условия разделения фенолов (концентрации фенолов, растворительдля приготовления растворов соединений, размеры пластин) и способ детектирования.Описан метод разделения хлорзамещённых фенолов методом ТСХ с использованиемалюминиевых пластин RP∗ −18F254s (Merck) [13]. Было изучено 12 систем подвижных фаз(толуол, толуол−метанол, толуол−вода, метанол−вода, ацетонитрил−вода и другие) вразличных объёмных соотношениях.Для разделения фенольных соединений был выбран элюент ацетонитрил−вода(70:30).
Результаты разделения приведены в табл. 4.Таблица 4Результаты хроматографического разделения фенолов на пластинах RP−18F254s.∗ФенолRfФенолRf2−Хлорфенол0,71Пентахлорфенол0,34RP−reverse phase−обратная фаза3−Хлорфенол0,702−Бутил−4−хлорфенол0,414−Хлорфенол0,702,3,5,6−Тетрахлорфенол0,292,4−Хлорфенол0,614−Хлор−2−метилфенол0,572,4,6−Трихлорфенол0,472,4,5−Трихлорфенол0,394−Хлор−3−метилфенол0,64Детектирование фенолов проводили сканированием в УФ области при 254 или 216нм.Данным методом определяли содержание пентахлорфенола в образцах кожи науровне концентраций 4мг в 100 г образца.Вработе[14]описанметодвыделенияиколичесивенногоопределенияпентахлорфенола в жире.
Пентахлорфенол извлекали из анализируемых образцов методомэкстракции с использованием метилхлорида.Хроматографическое разделение проводили на пластинке силикагеля (20х20 см),которая была предварительно обработана смесью метилхлорид−метанол (1 : 1) и высушенана воздухе. Авторы изучили более 40 подвижных фаз для хроматографирования. Смесьгексан−ацетон−метанол−ледяная уксусная кислота (35 : 10 : 5 : 0,1) была выбрана вкачестве оптимальной (Rf = 0,65). Для визуального детектирования пентахлорфенола напластинке использовали смесь 20 %−ный водный раствор AgNO3−ацетон−деионизованнаявода−конц.
раствор аммиака (8 : 20 : 20 : 12), в которую полностью погружали пластинку.На светлом рыжевато−коричневом фоне фиксировали тёмную коричнево−серую зону.Предел обнаружения пентахлорфенола данным методом составляет 50 нг;использование денситометра позволяет понизить предел обнаружения до 0,50 ppm.Изомеры аминофенолов (2 −,3− и 4−аминофенолы) можно разделить на стекляннойхроматографической пластинке RP−18W/UV254, используя в качестве элюента смесьацетон−вода (60 : 40) [15]. Детектирование проводили в УФ области при 254 нм.Предложена методика разделения гидрохинона и о−метоксифенола на сорбентеPOLIGRAM SilN−HR (Rf равны 0,34 и 0,63, соответственно). Подвижная фаза состояла изсмеси толуол−диоксан−ледяная уксусная кислота (90 : 25 : 4) [15].
Фронт растворителяравен 10 см (за 20 минут). Детектирование проводили раствором о−толидина.Описаны методы тонкослойного хроматографического разделения фенолов сиспользованием наносиликагеля, модифицированного NH2−группами с последующимУФ−детектированиемприхлороформ−метанол(9:5)254нм.можноИспользуяразделитьвкачествеп−крезол,элюентасмесь2,3−диметилфенол,2,4,6−триметилфенол; а используя смесь ацетон−хлороформ (50 : 50) − резорцин,гидрохинон, 1−нафтол и м−крезол. Аликвоты фенолов в обоих случаях составляют 200 нл[15].Сиспользованиемнаносиликагеля,модифицированногоCN−группами,иУФ−детектированием при 256 нм разделяли гидрохинон, пирокатехин и 2−нафтол.Подвижной фазой служила смесь толуол−этилацетат (80 : 20) [15].В работе [16] описан способ разделения хлор− и бромзамещённых фенолов методомТСХ на силикагеле, нанесённом на стеклянную подложку, Sil C 18−50.
В качестве элюентовиспользовали две системы: 1 М раствор аммиака в 40 % метаноле и 1 М раствор аммиака +0,1 М раствор NH4Cl в 40 % метаноле. Детектирование проводили последовательнопомещая хроматографические пластинки в пары NO2 и NH3.В работе [17] описан метод тонкослойного хроматографического разделения рядафенолов и фенольных соединений на силикагеле. Силикагель G наносили на стекляннуюпластинку (200×200 мм) слоем толщиной 0,2 мм, высушивали на воздухе и активировалипри температуре 110°С в течение 1 часа.Растворы фенолов концентрацией 4 мг/мл готовили растворением точных навесок вметаноле.
На пластинку силикагеля наносили аликвоты фенолов, равные 10 мкл.В качестве подвижной фазы были изучены 6 смесей:(I) хлороформ−метанол−уксусная кислота (90 : 10 : 1)(II) петролейный эфир (60−80°С)− этилацетат−муравьиная кислота (40 : 60 : 1)(III) бензол−диоксан−уксусная кислота (85 : 15 : 1)(IV) хлороформ−этилацетат−уксусная кислота (50 : 50 : 1)(V) толуол−ацетонитрил−муравьиная кислота (70 : 30 : 1)(VI) петролейный эфир(60−80°С)−метанол−уксусная кислота (90 : 10 : 1)Разделение проводили при комнатной температуре (около 20°С), сушили идетектировали фенолы четырьмя различными способами:1) Пластинку помещали в пары йода на 10 минут, после чего проявлялись жёлтыепятна.
Пределы определения составили 10 мкг для пирокатехина и 2 мкг для всехостальных фенолов.2) Хроматограмму опрыскивали раствором FeCl3 в метаноле (1 г безводного FeCl3 на100 мл метанола). Пятна большинства веществ прявлялись сразу, а пятна резорцина игидрохинона проявлялись после нагревания пластинки при 110°С в течение 10 минут.Предел обнаружения всех веществ составил 2 мкг.3)Хроматограммуопрыскивалисмесьюхлориджелеза(III)−феррицианид,приготовленной растворением 1 г безводного FeCl3, 1 г феррицианида калия K3[Fe(CN)6] инескольких кристаллов перманганата калия KMnO4 в 100 мл воды.
Все вещества давалисиние пятна непосредственно после опрыскивания пластинки раствором FeCl3–K3[Fe(CN)6].Предел детектирования всех веществ равен 2 мкг.4) Хроматограмму опрыскивали смесью ванилин–серная кислота (0,5 г ванилина в 100мл H2SO4–этанол (40 : 10)) и нагревали при 120оС 20 минут. Пределы детектированиясоставили 40 мкг для резорцина и 2 мкг – для всех остальных соединений.Результатытонкослойногоразделенияфенольныхсоединенийвразличныхрастворителях приведены в табл.
5.Таблица 5Величина Rf для фенольных соединений [17].Подвижная фазаФенолыIIIIIIIVVVIПирогаллол0,200,610,220.510,510,31Пирокатехин0,420,700,480,650,670,55Резорцин0,270,660,360,620,600,42Гидрохинон0,260,640,330,620,590,42Показано, что пирогаллол и резорцин в смеси с галловой кислотой можно разделять,используя системы II, III, IV, V.Система IV является наиболее подходящей для разделения двух изомеров : катехина иэпикатехина. Резорцин и гидрохинон имеют практически одинаковую подвижность во всехсистемах за исключением системы III, которая наиболее подходит для разделения этихвеществ.Установлено, что система FeCl3–феррицианид не очень удобна для детектированияфенольных соединений, так как фон пластинки приобретает темно–зелёный цвет и пятнатеряют контраст.Раствор FeCl3 окрашивает пластинку светло–жёлтый цвет, а пятна приобретаютфиолетовый, сине–зелёный, жёлтый или оранжевый цвета в зависимости от фенола, чтовполне удобно для визуального детектирования.Наиболее подходящим реагентом для детектирования пятан при разделениипирогаллола, резорцина, флороглцина, катехина и эпикатехина является система ванилин–серная кислота.Описанные в работе [17] системы для тонкослойного разделения феноловпредоставляют широкий выбор способа разделения и детектирования большого числафенолов, описанные системы детектирования пятен являются экспрессными и удобными.Экспериментальная частьГлава 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
