А.А. Ярилин - Иммунология (1112185), страница 70
Текст из файла (страница 70)
С помощью биоинформатикис использованием компьютерных программ разработаны алгоритмы длятаких расчетов. В первую очередь выбирают участки с преобладанием гидрофильных остатков над гидрофобными (условие локализации эпитопа наповерхности молекулы), а также с аминокислотными остатками, придающими этому участку гибкость. Детерминанты, смоделированные на основетаких расчетов, в настоящее время синтезируют и с успехом применяют всеродиагностике и для приготовления искусственных вакцин.3.2.1.4. Взаимодействие антигенов и антителФизико-химические основы взаимодействия антиген–антителоВ основе реакции антиген–антитело лежит взаимодействие между эпитопом антигена и активным центром антитела, основанное на их пространственном соответствии (комплементарности). Это взаимодействие состоит вустановлении между эпитопом и активным центром антитела нековалентных химических связей, в основе которых лежат следующие типы межмолекулярных взаимодействий (ни одно из них не является специфичным дляреакции антиген–антитело) (рис.
3.25):– электростатические; они включают ионные (между заряженнымигруппами аминокислотных остатков, например, карбоксильными иаминогруппами) и полярные (связанные с формированием диполей)взаимодействия;– водородные (связаны с формированием водородных мостиков междугидрофильными группами);– гидрофобные (обусловлены энергетическими преимуществами контакта гидрофобных участков молекул между собой);– силы Ван-дер-Ваальса (основаны на взаимодействии электронныхоблаков).2773.2. АнтигеныЭлектростатические силыR:CH2:CH2 NH3+:OOO CH2:CH2:RВодородные связиR:CH2:CH2 : O : H : O :Гидрофобные силыR:CH2 CH2 CH3CHRCH2:RCH3 CH3Ван:ден:Ваальсовы силы+::+:++:Рис.
3.25. Нековалентные связи, обеспечивающие взаимодействие антигена с антителом. Основные типы связей, играющих роль во взаимодействии антигена с антителом, обведены краснымВсе эти взаимодействия проявляются только при близком контактемолекул. Так, интенсивность электростатических взаимодействий убываетпропорционально квадрату расстояния, а ван-дер-ваальсовых сил — пропорционально 7-й степени расстояния.
Такое маленькое расстояние междумолекулами может быть достигнуто только за счет комплементарностиэпитопа и активного центра антитела.Аффинность антителВзаимодействие антигена с антителом обратимо и подчиняется законудействия масс, на основе которого рассчитывают константу равновесия.В реакции антител с гаптеном формула имеет вид:Kа = [AbH]/[Ab][H],где Ка — константа равновесия (или константа связывания); [Ab] — концентрация несвязанных антител; [H] — концентрация свободного гаптена;[AbH] — концентрация комплекса антитело–гаптен.
Размерность константы связывания — 1/моль.Часто бывает удобно использовать величину, обратную константе связывания, которая обозначается как константа диссоциации (Kd=1/Ka) ивыражается в молях.278Глава 3. Адаптивный иммунитетКонстанта связывания служит мерой сродства (аффинности) антител иможет рассматриваться как показатель специфичности антител к данному эпитопу. Для прямого экспериментального определения аффинностиантител используют метод равновесного диализа. Антитела помещают вдиализационный мешок, стенки которого проницаемы для гаптена, но недля антител.
Диализный мешок с антителами помещают в раствор гаптена,который начинает диффундировать в мешок по градиенту концентрации.После установления равновесия измеряют концентрацию гаптена внутри иснаружи мешка. Превышение первой величины над второй соответствуетколичеству гаптена, связавшегося с антителами. Результаты выражают вкоординатах Скэтчарда, используемых при количественной оценке параметров связывания различных веществ (например, лекарственных средстви их рецепторов). Это позволяет рассчитать величину Ка, т.е.
оценитьаффинность взаимодействия. Помимо кинетического подхода к оценкеаффинности существует термодинамический подход, основанный на анализе изменений свободной энергии при взаимодействии антиген–антитело. Аффинность антител существенно меняется в ходе иммунного ответа(«созревание аффинности» — см. раздел 3.6.2.2). При этом она возрастает от10-7–10-8 М до 10 -10 –10 -11 М.При использовании высокомолекулярных антигенов, содержащих большое число эпитопов, точное определение аффинности взаимодействиякаждого эпитопа со своим антителом становится невозможным. В этомслучае оценивают суммарное сродство (функциональную аффинность,или авидность).
Его определяют чаще всего по устойчивости иммунныхкомплексов к таким воздействиям, как повышение ионной силы раствора,способствующее разрыву связей между эпитопами и активными центрамиантител. Оценку проводят с помощью иммуноферментного или радиоиммунного тестов. Как правило, авидность взаимодействия с антителамицелого антигена выше, чем сумма взаимодействий с антителами индивидуальных эпитопов. Это превышение объясняют тем, что диссоциация каждой связи затрудняется при сохранении контакта молекул, удерживаемыхза счет других связей.Существует значительная трудность в определении аффинности поликлоналных антител в иммунных сыворотках из-за высокой степени ихгетерогенности. Эту проблему можно решить, используя моноклональныеантитела — антитела с идентичной аффинностью (получают, как правило,в культурах гибридных клеток).Методы оценки взаимодействия антиген–антителоЧасто возникает необходимость измерения взаимодействия антигена иантитела — как для определения содержания антител, так и для выявленияантигенов в биологических жидкостях и растворах.
Для этого применяют2 группы методов. Первая группа основана на непосредственной регистрации связывания антигенов и антител. Для этого один из компонентов(обычно антитела) метят и затем выявляют связывание меченного реагентас другим компонентом реакции. В качестве метки используют радиоактивные изотопы (радионуклиды), ферменты и флуоресцентные красители(флуорохромы).
Методы соответственно обозначают как радиоиммунные,2793.2. Антигеныиммуноферментные и иммунофлуоресцентные. Радиоиммунный анализобычно проводят в прямом варианте, т.е. содержание антигена определяютпо количеству связавшихся с ним меченых антител. Наиболее распространенные варианты иммуноферментного метода — конкурентный и двусайтовый. В первом случае оценивают степень ослабления связывания меченныхантител с антигеном, фиксированным на пластиковой поверхности, последобавления исследуемого реагента.
Во втором случае на пластике фиксируют немеченные антитела, специфичные к одному из эпитопов антигена, кним добавляют исследуемый материал и содержание в нем антигена определяют по связыванию меченных антител к другому его эпитопу. Схемыпостановки иммуноферментного теста представлены на рис. 3.26.Антитела, меченные флуорохромами, обычно применяют для изучения поверхностных антигенов клеток. Для выявления связывания раньшеиспользовали люминесцентную микроскопию. В настоящее время в цитологических исследованиях чаще применяют проточную лазерную цитометрию (люминесцентную микроскопию продолжают использовать в гистологических исследованиях).Другая группа методов оценки взаимодействия антител с антигенамиоснована на регистрации так называемых вторичных феноменов:– преципитации (осаждения) иммунных комплексов;– агглютинации (склеивания) частиц, несущих антиген (эритроцитов,частиц латекса и т.д.);– связывания и активации комплемента с последующим лизисом эритроцитов, несущих антиген и т.д.Схема иммуноферментного твердофазногоопределения цитокинов (ELISA)СА : ФМАТ: 2 : ФМАТ: 2 : БЦКЦКМАТ: 1МАТ: 1Моноклональные антитела (МАТ)Стрептавидин (СА)Цитокин (ЦК)Фермент (Ф)Биотин (Б)Рис.
3.26. Схема иммуноферментного твердофазного определения антигена (ELISA)на примере цитокина. Коричневая полоса — пластиковая поверхность, на которуюпоследовательно наслаивают указанные реагенты280Глава 3. Адаптивный иммунитетЭти методы просты, но возникают значительные трудности при ихавтоматизации и проведении их количественной оценки.
Результаты этихреакций оценивают титрами, т.е. последним разведением антител, дающимположительный результат. Использование этих методов сыграло огромнуюроль на ранних этапах развития иммунологии (тогда их применяли длявыявления антител и антигенов с целью диагностики многих инфекционных заболеваний).Эти методы послужили единственной методической основой работ, заложивших теоретические основы иммунохимии.
Так, анализ кривой преципитации, методы которого в 30-е годы ХХ века разработал М. Хейдельбергер(М. Heidelberger), позволил установить основные закономерности взаимодействия антигенов и антител, когда не только отсутствовала возможностьполучения чистых и гомогенных препаратов антител, но даже их природабыла неизвестна.
Кривую преципитации строили, измеряя количествобелка в осадке, образуемом при взаимодействии антигена с антителом(обычно к стандартному раствору антигена постепенно добавляли антитела и измеряли содержание белка в преципитате), а также концентрациюсвободных антител или антигена в растворе.
Эта кривая обычно имеетгорбовидную форму. Перед формированием максимального количествапреципитата находится точка эквивалентности, когда в растворе отсутствуют свободные антигены и антитела.Изучение и объяснение кривых преципитации привело к созданию теории решетки, согласно которой в основе формирования преципитата лежитбивалентность молекулы антитела и поливалентность антигенов (рис. 3.27).В результате при взаимодействии антигена с малым количеством антителобразуются растворимые комплексы из одиночных пар молекул.
По мереувеличения количества антител возникает возможность не только каждоймолекуле антитела связывать две молекулы антигена, но и разным молекулам антител взаимодействовать с одной и той же молекулой антигена. Врезультате формируется молекулярная «решетка», не способная удержатьсяв растворе и выпадающая в осадок. Формулы иммунных комплексов в зонеэквивалентности: АГ2 АТ2 , АГ3АТ3, АГ2 АТ3 (где АГn — число молекул антиге-1. Избыток антигена2. Зона эквивалентности3. Избыток антителРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
