Том 2 (1109662), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Это можно использовать для фотометрического контроляпротекания ферментативной реакции. Индикаторной реакции может предшествовать вспомогательная — как показано на следующей схеме.v" Ферментативная реакция (основная):субстрат + АТФфермент^=±субстрат-фосфат + АДФ.Вспомогательная реакция:-%>••АДФ + фосфоенолпируват F± пируват + АТФ.8.3. Ферментативные и иммунохимические методы233Индикаторная реакция:пируват + НАДН + HОIlпH**з*-->ч ^ C vIl"пируватH3C^4 s|Nо н+^ лактат + НАД + .В этой схеме АДФ и АТФ —сокращенные обозначения аденозин-5'-дифосфата и аденозин5'-трифосфата, соответственно(рис. 8.21). В качестве индикатора снова использован НАДН.Контроль реакции — фотометрическии, по поглощению светапри 340 нм (рис.
8.20).ОO OP-^^ -^ о ^O OР\ОP^- -v^oоРис. 8.21. Структурная формула аденозин-5'-трифосфата (АТФ).Иммунный анализЕще одно направление развития биохимических методов анализаосновано на использовании иммунохимических процессов. В основеметодов иммунного анализа лежат взаимодействия антиген-антитело.При попадании в организм человека или животного чужеродного высокомолекулярного вещества природы вступает в действиеиммунная система. Она вырабатывает специальное вещество, способное связать постороннее вещество и, таким образом, его обезвредить.
Чужеродное вещество называется а н т и г е н о м , а вырабатываемое иммунной системой «противоядие» — а н т и т е л о м . В результате реакции антигена (Ag) с антителом (Ak) образуется иммунныйкомплекс:-ш-\ч ' .'4±+ U^Г ^ -<•>,HOi.д1^Ддиммунныйкомплекс(8.27)234Глава 8. Специальные вопросы аналитической химииВпервые иммунные реакции в аналитической химии были использованы в 1950-е годы, для определения инсулина в плазме кровис использованием антител против инсулина.Антитела представляют собой вещества белковой природы. Примером может служить гамма-глобулин (в форме так называемогоIgG-глобулина).
Антигенами, как уже упоминалось, являются высокомолекулярные вещества (например, белки, пептиды или полисахариды) с молекулярными массами свыше 1000. Принципиальновозможно определять иммунохимическими методами и низкомолекулярные вещества. Для этого их надо предварительно связать скаким-либо белком-носителем. Такое связанное с белком низкомолекулярное вещество называется г а п т е н о м .Основными принципами детектирования в иммунных методаханализа служат измерение люминесценции, активности ферментаили радиоактивности. Мы рассмотрим две разновидности иммунного анализа — радиоиммунный анализ (РИА) и гетерогенный иммуноферментный анализ (ИФА).Радиоиммунный анализ (РИА)В методе радиоиммунного анализа удачно сочетаются высокая селективность реакций антиген—антитело и высокая чувствительностьрадиохимических методов анализа (раздел 3.6).
Эти методы позволяют определять концентрации вплоть до нескольких пикограммовв миллилитре.Радиоиммунные методы основаны на конкурирующем комплексообразовании определяемого вещества — природного антигена Ag —и синтетического меченого (радиоактивного) антигена Ag* — с антителом Ak:-"н-> .о Ag + Ak^AgAkК= It^llv^ 8 - 28 )[AgJ[AkJAg* + Ak ^ Ag*Ak= М - .(8.29)[Ag J[AkJПри этом необходимо соблюдение следующих основных условий./ГС-Г• Концентрации меченого антигена и антитела во всей серии измерений должны оставаться постоянными. Единственной переменной величиной является концентрация определяемого антигена.Меченый антиген берется в избытке по отношению к антителу.
Число молекул меченого антигена должно быть больше,чем общее число мест связывания в молекулах антитела.v8.3. Ферментативные и иммунохимические методы 235• Константы ассоциации определяемого и меченого антигена Ки К* должны достаточно различаться между собой. Как правило, такие константы имеют порядок величины от 1010 до1013 л-моль -1 .,-гПри взаимодействии с антителом смеси[Ад'Ак]меченого и определяемого антигена имеютместо процессы конкурентного комплексообразования (уравнения (8.28) и (8.29)).Ввиду этого концентрация меченого комконцентрация определяемого вещества (антигена)плекса Ag* Ak тем выР и с .
8.22. Градуировочная зависимость для ра ше, чем меньше кондиоиммунного метода анализа. Индикаторное ве центрация Ag. Завищество — меченый комплекс Ag* Ak.симость концентрациимеченого комплекса отконцентрации Ag имеет S-образный вид и может служить для градуировки (рис. 8.22).Ход градуировочной зависимости, представленной на рис.
8.22, впринципе возможно рассчитать на основании закона действующихмасс (см. главу 2). Однако на практике предпочитают пользоватьсяэмпирическими зависимостями, поскольку реальный процесс взаимодействия антиген -антитело обычно протекает сложнее, чем этопредставлено уравнениями (8.28) и (8.29) (за счет наличия множества различных центров связывания, образования комплексов разного состава и т.д.).Концентрацию комплекса антитела с меченым антигеном определяют посредством измерения радиоактивности.
Для этого комплекс предварительно отделяют от непрореагировавшего избыткамеченого антигена. Разделение осуществляется очень легко, если антитело иммобилизовано. Обычно последовательность операций привыполнении радиоиммунного анализа выглядит следующим образом.• Иммобилизация антитела, например, на внутренней поверхности реакционного сосуда.• Проведение иммунной реакции с участием пробы, в которуюдобавлен меченый антиген.• Отделение непрореагировавших веществ путем промыванияповерхности сосуда.• Измерение радиоактивности стенок сосуда.236Глава 8.
Специальные вопросы аналитической химииИспользование радиоактивной метки 125 IСреди огромного множества радиоактивных изотопов наиболее подходящими радиохимическими свойствами для синтеза меченых антигенов обладают 3 2 P, 3 5 S, 3 H, 1 4 C, 57 Co и 1 2 5 I. Использование 3 2 P,35S и 3 H удобно еще и тем, что соответствующие элементы входятв состав большинства биологических веществ, определяемых радиоиммунным методом.
Кроме того, они являются достаточно мягкимиизлучателями, и работа с ними требует соблюдения лишь относительно простых правил техники безопасности. Однако чаще всегоиспользуют изотоп 125 I. Он является чистым 7- и з л У ч а т елем, а егопрепараты легко доступны и могут быть получены в виде веществсо 100%-ной изотопной чистотой. Период полураспада изотопа 125 Iдостаточно велик и составляет 60 суток, а энергия его излученияотносительно низкая.При синтезе и работе с препаратами, меченными 125 I, следуетиметь в виду ряд важных моментов.• Если молекула определяемого вещества содержит иод, то воз_чь«:, можен нежелательный процесс изотопного обмена между определяемым и меченым антителом. Примерами биологически ак;,тивных иод со держащих соединений могут служить гормоныщитовидной железы — тироксин и трииодтиронин.• Введение изотопной метки 125 I легко осуществимо, если молекула содержит остаток тирозина или гистидина (как, например, у многих белковых гормонов).
В этом случае для введения метки достаточно использовать смесь Na 125 I и окислителя,например, хлорамина T. Реакция протекает по следующей схеме:2 1 2 5 I"хлораминТ>125I 2 -* 125 1+ +125I-.(8.30)•itxm o*t<ОНОН+ 2125I+Rl^CH,CHynj остаток| тирозилаR24«W(8.31)Rl,CH2*СН^HH остаток| 2,3-дииодтирозилаR2»Если молекула не содержит удобных мест для введения метки125I, то метку можно ввести вместе с остатком тирозила.8.3. Ферментативныеи иммунохимическиеметоды237TOiVf. Синтез иммуногеновКак мы уже отмечали, к иммунным взаимодействиям способны лишьвысокомолекулярные соединения с молекулярной массой свыше 1000.Такие вещества можно определять как антигены непосредственно.Низкомолекулярные соединения-гаптены — стероиды, триазины идр.
— сами по себе не вступают в иммунохимические реакции. Дляопределения таких веществ их необходимо предварительно связать сбелком-носителем в высокомолекулярный продукт, называемый иммуногеном:белок-носитель + гаптен ^ иммуноген.(8.32)Белком-носителем чаще всего служит человеческий или бычийальбумин.
На рис. 8.23 приведен пример синтеза иммуногена посредством реакций по аминным группам. Сначала аминогруппы гаптенаи белка связывают с карбонильными группами глутарового альдегида с образованием двойного шиффова основания. Затем продуктреакции восстанавливают для придания ему большей химическойустойчивости.Hгаптен — N H ,2+^CH2.vСH2C^H1CуИСIlIlоо+ H-NбелокICH.гаптен - N = H C ^яH-C"Н 2 С" " 4 C H = N - белок*+2H2OJNaBH3CN^CH2.гаптен_NH_H2CH2CxH2CCH2-HNбелокР и с . 8.23. Схема синтеза иммуногена по реакции глутарового альдегида саминогруппами гаптена и белка.Примеры использования радиоиммунного метода анализа дляопределения различных веществ приведены в табл. 8.7.Гетерогенный иммуноферментный анализИспользование ферментов в иммунных методах анализа позволяетосуществить более простой способ детектирования по сравнению238Глава8.
Специальныевопросыаналитическойхимиис РИА. В методе иммуноферментного анализа (ИФА) используютантиген, меченный не радиоактивным изотопом, а ферментом.Т а б л и ц а 8.7.Примеры определения веществ иммунохимическими методами.Определяемое веществоОтносительная молекулярная массаМетодИнсулин (белковый гормон)5734РИАПенициллин G334РИАМорфин285РИАТрипсин (белок)24000РИААтразин179,5ИФАБензол, толуол, ксилолот 79 до 116ИФАВенз[а]пирен252РИАКак правило, иммуноферментный анализ проводят в гетерогенном варианте.
В этом случае, как и в методе РИА, молекулы антитела иммобилизуют — часто посредством простой адсорбции наактивной поверхности. В результате протекания конкурирующихреакций с участием определяемого и меченого антигена часть последнего оказывается связанной в комплекс с антителом и, такимобразом, также сорбированной на поверхности. Реакционный сосуд отмывают от избытка несвязанного меченого антитела и добавляют необходимый субстрат с тем, чтобы определить содержаниефермента, сорбированного на поверхности вместе с меченым антителом.
Как и в других ферментативных реакциях, для определенияфермента, как правило, применяют кинетический метод с фотометрическим детектированием.Пределы обнаружения различных веществ методом гетерогенного ИФА находятся в области от нанограммов до микрограммов влитре. Примеры практического использования этого метода приведены в табл. 8.7. Как видно из таблицы, метод позволяет определятьвещества, важные как для медицины, так и с точки зрения контроляокружающей среды.Антитела, применяемые в иммунохимических методах анализа,представляют собой, по существу, специфические реагенты на самые разнообразные вещества, создаваемые самой природой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
